分光光度法定量测定烟草叶面分泌物含量研究

张小全，杨志晓，李钦奎，李 伟，杨铁钊

(河南农业大学 烟草学院，河南 郑州450002)

烟草叶面分泌物与烟叶香气物质密切相关，其含量高低对烟叶香气质量有重要影响［1］.一般而言，烟草叶面分泌物较多，粘性较大，表现出较浓的香味，去除表面分泌物后烟叶香气和口味明显减弱.烟草叶面分泌物主要由烟叶表面腺毛的腺头细胞分泌的萜醇类物质与糖酯类物质和由烟叶表面细胞分泌的蜡质、脂质、挥发性碳氢化合物以及其他复杂的高分子化合物或简单的低分子链烃物质组成［2-3］.大量的研究表明，烟草叶片分泌物的多少受品种、生态环境、栽培技术等多种因素的影响［4-8］.研究不同材料在不同栽培措施下的叶面分泌物产生规律，将对烤烟新品种选育和优质烤烟栽培技术的实施，提高烟草香气的质和量都具有重要的指导意义.

烟草叶片分泌物的测定方法虽经多年探索，但目前国内外采用的方法仍主要是用二氯甲烷萃取叶面、GC/MS定性和定量分析叶面分泌物［7-9］，该方法测定时间长，方法繁琐，且成本高.用有机溶剂萃取，浓缩、干燥后称量测定的方法需要大量的叶面分泌物，而且该方法复杂，费时费事，操作中易造成一定的损失，导致定量检测结果不够准确.分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术，具有灵敏度高、操作简便快速的特点，对于复杂的组分系统，无需分离即可检测出其中所含的微量组分.本文采用分光光度法对叶面分泌物进行定量分析，探讨烟草叶面分泌物快速定量测定方法.

1 材料与方法

烤烟品种(系)为 K326、NC89、8541、红花大金元、铁把子和香料烟Basma，种植于河南农业大学科教试验园区.土壤类型为沙壤土;全氮0.9 g/kg，速效氮56.3 mg/kg;全钾 13.5 g/kg，速效钾 124.56 mg/kg;速效磷5.3 mg/kg;有机质13.6 g/kg.4月25日移栽，田间管理按优质烟生产要求进行.移栽后跟踪观察，选择长势一致的烟株，从下部可烤叶算起，对第12、13片叶挂牌标记，当叶片生长将至工艺成熟期(九成熟)时，采收成熟度一致的叶片用于烟草叶面分泌物提取.

参照韩锦峰等［9］的烟草叶面分泌物的萃取方法.得到的萃取溶液在40℃、常压情况下浓缩至30 mL，移入50 mL玻璃瓶中，低温(0℃)避光保存.

将上述待测样转移并用二氯甲烷定容至50 mL，再稀释4倍，进行全波长扫描.将UNICO2102-PC紫外-可见分光光度计开机预热30 min后，用二氯甲烷作基线、调零，然后用光程为1 cm的立方石英比色杯盛待测液，加盖玻璃盖子，以防二氯甲烷挥发.对待测液在200～1 000 nm波长范围内连续扫描，每次移动1 nm.分别扫描得到全波长光吸收图谱，比较确定用于测定标准样品的适宜波长范围.

取上述6个烟草基因型的定容后待测液各20 mL混合，用水浴锅于45℃下充分浓缩成膏状物，且无二氯甲烷气味，可得标准样品，供配制系列浓度梯度的标准样品溶液.在1/10 000电子天平上称取浓缩后的膏状物0.113 5 g，用二氯甲烷定容至100 mL，作母液.分别从母液中移取 0.5、1、2、3、4、5、8 mL，定容于25 mL容量瓶中.在选定波长下测得标准溶液的光密度，制作标准样品曲线及回归方程式.

将6个基因型的待测样剩余部分按照标准溶液的制作方法浓缩后称质量，定容，制得已知浓度的溶液，分别测得光密度，用回归方程计算其浓度，检验回归方程的误差范围.

2 结果与分析

2.1 叶面分泌物萃取液特征吸收光谱分析

通过比较5个烟草基因型的叶面分泌物萃取液在200～1 000 nm范围的光吸收图谱(图1)可知，各个烟草基因型的叶面分泌物萃取液在紫外光区均有明显的吸收单峰，吸收峰稳定在235 nm附近，不同烟草类型和不同烤烟基因型间叶面分泌物萃取液吸收峰位变化很小.根据化合物结构与光吸收的关系，在紫外区产生光吸收的物质必须具有不饱和结构.烟草叶面分泌物的主要化学成分萜醇类物质具有不饱和结构，与此吸收峰关系密切.

图1 不同烟草基因型叶面分泌物萃取液的全波长扫描图Fig.1 The spectrums of leaf surface glandular exudates of the different tobacco genotypes

2.2 标准样品溶液回归方程的建立

以二氯甲烷作对照，将制得的已知浓度的标准溶液在235 nm波长下分别比色，记录光密度，并以此建立吸收曲线和回归方程(图2).该吸收曲线和方程的决定系数(R2)=0.999 6.不同浓度的分泌物萃取液在该波长下光密度变化灵敏，测得光密度后，用回归方程计算的浓度与已知浓度的误差在5%以内.根据朗伯-比尔定律，标准样品的光密度在0.2～0.8范围内，所得的回归方程线性最好，待测样品溶液的光密度控制在该范围内，通过回归方程计算得到的浓度才能很好地和实际浓度吻合.因此确定235 nm的波长作为烟草叶面分泌物萃取液的吸收检测峰.

图2 叶面分泌物萃取液的光密度标准曲线和标准回归方程Fig.2 The absorbency standard curve and the equation of leaf surface glandular exudates

2.3 回归方程的误差检验

将6个基因型的叶面分泌物萃取物浓缩至膏状，取部分萃取物称质量，用二氯甲烷溶剂配制成已知浓度的溶液，并且使得溶液的光密度大致在0.2～0.8范围内.分别用UNICO2102-PC紫外-可见分光光度计测已知浓度溶液的光密度，并通过回归方程计算得到相应的浓度，计算测得浓度和实际浓度之间的误差.结果(表1)表明，由回归方程得到的浓度和已知浓度的误差均能控制在5%以内，说明通过标准溶液建立回归曲线和方程，再利用比色值得出溶液浓度的方法是可行的.可以作为定量测定烟草叶面分泌物的一种简便、准确的方法.

表1 叶面分泌物萃取液和标准回归方程准确度检测Tab.1 The veracity testing of the standard curve and the equation of the exudates from tobacco leaf surface glandular

3 结论

通过烟草不同的类型和基因型的叶面分泌物萃取液的全波长扫描，发现本试验各个样品的最大光密度均在紫外光区235 nm附近，而且呈单峰曲线，因此较容易确定最大吸收峰位置.用不同浓度的标准溶液在235 nm波长下分别比色，建立标准回归方程.对12个已知浓度样本的检测结果表明，由回归方程得到的浓度和已知样本浓度的误差均能控制在5%以内，说明在该波长下建立的标准回归方程的准确度能达到定量检测的要求.

烟草叶面分泌物主要化学成分为萜醇类物质，是烟草的重要致香前体物质［4-5］，具有紫外光区吸收所必需的不饱和结构.因而，在紫外光区235 nm下检测的叶面分泌物与烟草致香前体物质关系密切.本试验建立的定量方法检测出烟叶叶面分泌物的多少，可以反映烟叶表面主要致香前体物质的量，但只能代表烟叶香气的一部分，定量出的物质对烟叶总体香气的贡献和影响有多大，还有待进一步研究.

用分光光度法对叶面分泌物进行定量检测，可实现烟草叶面分泌物的简便、快速、低成本、大批量、有效定量测定，为利用叶面分泌物指标进行高香气烟草新品种选育和优质烤烟栽培技术研究奠定基础.

［1］史宏志，官春云.烟草腺毛分泌物的化学成分及遗传［J］. 作物研究，1995，9(3):46-49.

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［9］韩锦峰，王广山，王彦亭，等.烤烟叶面分泌物的初步研究［J］.中国烟草科学，1995(2):10-12.