HPLC法测定清火片中大黄素和大黄酚的含量及含量均匀度

姚 亮

湖南省衡阳市中心医院药剂科，湖南 衡阳 421001

清火片由大青叶、大黄、石膏、薄荷脑等4味药组成的复方制剂，功能清热泻火，通便。用于咽喉肿痛，牙痛，头目眩晕，口鼻生疮，风火目赤，大便不通等。其质量标准收载于卫生部标准第2册第244页收载品种。［1］大黄为本方中有效成分之一，而大黄主要成分为大黄素和大黄酚，因此测定本品中大黄素和大黄酚的含量，可作为本品质量控制的指标之一。为了更好的控制该制剂的质量，保证药品使用安全、有效，参考有关文献［2－4］，本文采用 HPLC法测定了大黄素和大黄酚的含量及含量均匀度。

1 仪器与试药

仪器 日本岛津LC－10A高效液相色谱仪，SPD－10AVP紫外检测器;LC－10ATVP7725(i)型手动进样器;威玛龙色谱工作站;phenomenex HyperClone柱 (C18，4.6×250mm，5μm);kh－250db型超声处理器 (昆山禾创超声仪器有限公司)。

试药 甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。大黄素、大黄酚对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为:110756－200110、110796－200412。清火片 (购自A厂，共3批)。

2 实验方法与结果

2.1 谱条件 色谱柱:phenomenex HyperClone柱 (C18，4.6×250mm，5μm);流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液 (85∶15)，流速为1.0ml· min－1，检测波长为254nm，进样量为20μl;柱温为室温;理论板数按大黄素峰计算应不低于2000。在上述色谱条件下，大黄素、大黄酚能完全分离，对照品与阴性对照品溶液中没有峰重叠，色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素和大黄酚对照品各10.0mg，分别置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取大黄素对照品溶液2.5ml，大黄酚对照品溶液20ml，置100ml容量瓶中，加甲醇制成每1ml含大黄素2.5ug、大黄酚20ug的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取1g，置锥形瓶中，精密加乙醇50ml，密塞，称定重量，置水浴上加热回流1小时，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，置烧瓶中，水浴蒸干，加30%乙醇－盐酸 (10∶1)混合液15ml，置水浴中加热回流1小时，立即冷却，用三氯甲烷强力振摇提取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣用无水乙醇－醋酸乙酯 (2∶1)溶解，移置25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，以上述色谱条件测定，根据大黄素、大黄酚峰面积，以外标法计算供试品中大黄素、大黄酚含量。

2.5 线性关系考察 精密称取大黄素和大黄酚对照品各10.0mg，分别置100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成100μg· ml对照品溶液，备用。(1)、分别精密吸取 100μg· ml－1大黄素对照品溶液 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5ml，分别置100ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得 (每1ml中含大黄素分别为0.5μg、1.5μg、2.5μg、3.5μg、4.5μg、5.5μg)，进样测定。以对照品进样浓度为横坐标 (X)，峰面积积分值为纵坐标 (Y)绘制标准曲线，Y=34528X－1075.5，相关系数r=0.9995;(2)、分别精密吸取100μg· ml－1大黄酚对照品溶液2.5、5、10、15、20、25ml，分别置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得 (每1ml中含大黄酚分别为 5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg)，进样测定。以对照品进样浓度为横坐标 (X)，峰面积积分值为纵坐标 (Y)绘制标准曲线，回归方程为:Y=50351X－18680，相关系数r=0.9992。结果表明:大黄素进样浓度在0.5～5.5μg· ml－1范围内，大黄酚进样浓度在5～50μg· ml－1范围内，进样浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 分别精密吸取大黄素、大黄酚混合对照品溶液 (大黄素2.5μg· ml－1、大黄酚20μg· ml－1) 和供试品溶液 (批号20100601)各20μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，依次测定峰面积值，其中大黄素RSD为0.41%、大黄酚RSD为0.26%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液 (批号20100601)，每隔4小时分别进样20μl，测定大黄素、大黄酚峰面积值，其峰面积RSD分别为1.39%、1.83%，表明供试品溶液在20小时内保持稳定。

2.8 阴性对照试验 按处方比例取处方中缺大黄的各味药材，照制法制取缺大黄样品。取阴性样品1.0g，并按供试品溶液提取方法制成阴性对照溶液，测定，在上述色谱条件下，缺大黄阴性对照溶液，在大黄素和大黄酚色谱峰处无干扰峰出现，表明对被测成分无干扰。

2.9 重复性试验 取同一批号供试品 (批号20100601)共5份，每份约1g，精密称定，按供试品溶液项下的方法制备，测定，结果测得总量平均值1.743 mg/片，RSD%=0.38，大黄素平均值0.223 mg/片，RSD%=1.54，大黄酚平均值1.521 mg/片，RSD%=0.28，表明重复性良好。

2.10 加样回收率试验 加样回收试验:取已测知含量的供试品 (批号050315，含量:总量1.743 mg/片，大黄素0.223 mg/片，大黄酚平均值1.521 mg/片)5份，每份约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入100μg· ml－1大黄素对照品溶液 (精密量取大黄素对照品溶液10.0mg，置100ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得)4.7ml和大黄酚对照品3mg，照供试品溶液项下的方法制备，测定，结果见表1和表2。

表1 大黄素加样回收试验结果

表2 大黄酚加样回收试验结果

2.11 样品中大黄素、大黄酚的含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液3批，按上述色谱条件测定，以外标法计算，结果见表3。

2.12 样品中大黄素、大黄酚的含量均匀度测定 取样品3批，按供试品溶液制备方法提取，以上述色谱条件依法(2010年版药典二部附录XE)测定大黄素、大黄酚含量均匀度，结果见表3。

表3 样品含量及含量均匀度测定结果

3 讨论

HPLC在选择检测波长时，取大黄素和大黄酚对照品适量，甲醇为溶剂，经紫外－可见分光光度计扫描，大黄素和大黄酚在254nm处有最大吸收，灵敏度高，因此，选择254nm作为检测波长。本实验研究表明，该方法操作简便，重现性好，灵敏度高，样品分离效果好，可用于清火片的质量控制方法。

［1］卫生部药品标准［S］.中药成方制剂，第二册，WS3－B－041－90.

［2］刘善新，马毅，钟方晓，等.HPLC法测定复方大黄利胆片中大黄素、大黄酚的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2007，13(12):13－14.

［3］周勇高，韩燕全，孟楣.HPLC法同时测定苦黄软膏中大黄素、大黄酚的含量［J］.安徽医药，2011，15(4):430－431.

［4］盛燕，汪培钧，张文婷，等.高效液相法测定妇乐颗粒中大黄素和大黄酚的含量［J］.中国药业，2010，19(8):46－47.