止痢草提取物对患病罗非鱼组织器官的影响

叶金明 金立志 郑宗林

植物提取物是芳香、挥发性化合物的混合物，根据植物材料的芳香特性而命名并由这些植物提取获得。止痢草（牛至）植物提取物（香芹酚和百里香酚）、肉桂植物提取物（肉桂醛）、麝香草属植物提取物（麝香草酚）和芸香料灌木提取物（甲基紫罗兰酮）等4种植物提取物的纯化成分已有较多研究和报道，很多研究报道了肉桂属、麝香草属和止痢草植物提取物具有广泛的体外抗微生物活性。揭示了植物提取物主要成分的体外抗微生物活性是源于植物精油的活性作用。金立志（2007）综述了一些植物提取物的研究及应用情况。在抗菌方面，止痢草提取物抗菌能力较强，特别是止痢草提取物性质稳定易于使用。但对于止痢草提取物在水产动物中抗菌性能的研究还未见报道。嗜水气单胞菌是淡水鱼流行性败血症的主要致病菌。本试验对罗非鱼进行嗜水气单胞菌攻毒，同时饲料中拌喂止痢草提取物，通过组织切片和电镜观察等手段观察感染嗜水气单胞菌的罗非鱼组织器官的病变情况，及止痢草提取物对组织器官的保护、抗菌性能。

1 材料与方法

1.1 试验条件

1.1.1 试验设计

试验用吉富品系尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）购自重庆市铜梁县温泉渔场。试验开始前停饲24 h，选择体重接近（22.0±1.0）g的幼鱼 90尾，随机分配于9个养殖缸，具体分组见表1。

表1 试验设计

1.1.2 试验饲料

采用罗非鱼常规商业配方，具体日粮配方及营养水平见表2。

1.1.3 注射感染

各组投喂相应的饲料3周后，以腹腔注射的方式使罗非鱼感染嗜水气单胞菌。试验菌株取自上海海洋大学国家水生动植物病原库，菌株号：ST 78－3－3。将嗜水气单胞菌涂布于营养琼脂上，28℃下培养过夜，以制备菌悬液。梯度稀释制备菌悬液：用0.9%的无菌生理盐水将嗜水气单胞菌从营养琼脂平板上洗下菌落，采用活菌直接镜检计数法计菌数，推算出菌悬液的活菌数，并将上述悬液稀释得到107cfu/ml。阴性对照组每尾鱼注射0.1 ml无菌生理盐水，阳性对照组、OS组每尾鱼注射0.1 ml的菌悬液（107cfu/ml）。注射后168 h取阳性对照组和OS组病症明显、但未死亡的罗非鱼，及从阴性对照组随机取鱼，分离各组织器官固定，每组取3尾。

表2 罗非鱼基础饲料配方及营养水平(%)

1.2 主要试剂与器材

1.2.1 Bouin's固定液

饱和苦味酸水溶液75 ml、福尔马林25 ml和冰醋酸5 ml混合均匀保存于阴暗处。

1.2.2 Ehrlich氏苏木精染色液

混合50 ml纯酒精与5 ml冰醋酸，然后将1 g苏木精溶解其中，并加入50 ml甘油。另将5 g钾明矾（硫酸铝钾）加入50 ml蒸馏水内加热使其溶解，再慢慢倾入上述已配制的混合液，随之搅拌。过滤后静置2～4周后尚能成熟，也可加入双氧水以缩短成熟的时间。

1.2.3 伊红染色液

0.5g固体伊红溶解在100 ml 95%的酒精中，加热后磁力搅拌器搅拌使其充分溶解。

1.2.4 0.1 M磷酸盐缓冲溶液(PBS)pH值7.3（sorensen配方）

A液为0.2 M磷酸二氢钠水溶液(27.6 g NaH2PO4·H2O或31.21 g NaH2PO4·2H2O溶于1000 ml双蒸水)；B液为0.2 M磷酸氢二钠水溶液（35.61 g Na2HPO4·2H2O 或71.64 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 ml双蒸水)。A液与B液按23：67体积比例混合。

1.2.5 二甲砷酸盐缓冲液

A 液（0.4 M 二甲砷酸钠贮存液）：Na(CH3)2·AsO2·3H2O 8.65 g溶于1000 ml双蒸水。

B液（0.2 M 盐酸溶液）：HCl(36%～38%)1 ml，加双蒸水到60 ml。

取25 ml A液、3～4 ml B液混合，测pH值，可用B液调pH值到7.3左右，再加双蒸水到50 ml，配成的二甲砷酸钠浓度为0.2 M。最后配成的固定液中加入1～3 mM的钙离子，可使结构保存更好。

1.2.6 Palade醋酸—巴比妥缓冲液（Palade配方）

A液（巴比妥钠2.89 g、无水醋酸钠1.15 g溶解于100 ml双蒸水中）；B 液[HCl(36%～38%)8.6 ml，加双蒸水到1000 ml]。临用时按下列比例混合：A液5 ml、B液5 ml(调整B液的量可得到所需的pH值)、双蒸水15 ml。

1.2.7 2%锇酸（四氧化锇）固定液贮存液的配制

先将4只装有四氧化锇的安瓿（共2 g）用肥皂水洗净，再用洗洁液浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用玻璃划割器在上面划痕，再用蒸馏水冲洗几次，放入洁净棕色广口玻璃瓶内，加上100 ml双蒸水，用洁净玻璃棒捣破安瓿，或用力摇破。然后用蜡严密封口，贴上标签备用。洗净后的安瓿严禁与手或纱布、滤纸等接触。将配好的2%四氧化锇置于干燥器中，于4℃保存。

1.2.8 磷酸缓冲的四氧化锇固定液的配制

等量的0.1 M磷酸缓冲液（pH值7.3）与2%四氧化锇贮存液混合，临用时现配。

1.2.9 二甲砷酸盐缓冲的四氧化锇固定液的配制

等量的0.2 M二甲砷酸盐缓冲液(pH值7.3）与2%四氧化锇贮存液混合，临用时现配。

1.2.10 Palade醋酸—巴比妥钠缓冲的四氧化锇固定液的配制

取Palade醋酸—巴比妥钠缓冲5.0 ml与12.5 ml的2%四氧化锇贮存液混合，再分别加入0.1 M的盐酸5.0 ml、双蒸水2.5 ml即可。

1.3 石蜡切片制作

1.3.1 组织固定

分别取人工感染试验中发病罗非鱼和对照组存活的健康罗非鱼的鳃、肝脏、心脏、腹神经节等组织器官，按照龚志锦的方法Bouin's固定液固定24 h以上，保存。

1.3.2 水洗及脱水

倒掉固定液后用微流水洗涤过夜。依次经30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%及 100%酒精两次脱水处理，每级脱水时间30 min。

然后经过透明、透蜡和包埋处理，最后进行切片与烘片。常温下切片，切片厚度10 μm。每个组织块切20片，蛋白胶固定。展片台上展片后放入37℃烘箱中烘72 h。

1.4 染色及封片

在58℃烘箱中经二甲苯20 min两次脱蜡后放入 1：1二甲苯与纯酒精 5～10 min后依次放入100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%的酒精中进行处理，每级5～10 min，然后放入纯水中处理5～10 min。

经苏木精染色，切片脱水及伊红复染，最后进行切片透明及中性树胶封片，并采用OLYMPUS显微镜观察和拍片。

1.5 超薄切片制作

取罗非鱼肝脏进行组织超薄切片的制作。超薄切片按照常规方法进行制作，即组织块经戊二醛—锇酸双固定，梯度酒精脱水，环氧树脂Epon 812包埋，Leica超薄机超薄切片，醋酸双氧铀—柠檬酸铅双染色法染色后，使用日立H－6000型透射电镜观察并且拍照。

2 结果

2.1 感染症状

罗非鱼腹腔注射嗜水气单胞菌后，主要症状为摄食量下降，活动能力减弱。48 h后腹部出现增大，腹腔注射部位红肿，口部、各鳍基部、鳃盖及鳃裂后部均有出血症状，眼球外突。部分罗非鱼鳃盖凹陷，鳃丝发白，肛门红肿呈濒死状态。解剖后观察可见肝胰脏呈土黄色，心、脾颜色暗红，肠道少或无食物。各种症状表明，嗜水气单胞菌对罗非鱼肝、肾、脾、心、肠、鳃都造成不同程度的破坏，特别是对肝、肾和鳃的破坏程度较大。

2.2 肝细胞超显微病理（见图1）

电镜照片主要观察了肝细胞的重要器官线粒体的形态变化。与阴性对照组相比，超薄切片OS组的肝细胞内可见部分线粒体的内嵴折叠、变形甚至断裂，失去正常的船梁结构，同时可见髓样小体肿胀，部分肿胀破裂（见图1－A）。而阳性对照则病变更加严重，某些组织坏死成一片无结构的区域（见图1－C），而图1－B为正常的线粒体，图1－D为嗜水气单胞菌的电镜照片。

2.3 肝脏及鳃显微病理（见图2）

2.3.1 肝脏

正常罗非鱼肝脏由无数肝小管组成。大体分为两瓣，呈三叶状，每一叶由许多小的分支的盲管组成，这些盲管通到每一叶的收集管，这三叶的收集管通过肝脏的主导管与中肠联系。每一肝小管都是由位于基膜上的单层柱状上皮细胞构成，细胞间界线清晰（见图2-A）。OS组的罗非鱼，其肝细胞部分水肿、变性，细胞排列可见轻度紊乱，部分细胞核坏死消失；随后肝小管上皮细胞间界线消失，细胞坏死，见坏死物脱落入肝小管管腔(见图2-B)；阳性对照组的罗非鱼肝细胞病变更加严重，可见肝小管上皮增生，核大小不一，有的细胞水肿变性，细胞核固缩、碎裂或崩解（见图2-C）。

图1 肝细胞超显微病理

图2 肝脏及鳃显微病理

2.3.2 鳃

正常罗非鱼每条鳃由一扁平的鳃轴及其向两边发出的许多鳃叶组成。鳃叶最外面是角质层，向内是上皮细胞层，中间是鳃腔。上皮细胞向鳃腔突起形成隔，将鳃腔分成许多小通道，其内常有大而胞质着色浅的细胞，通道内有游离的血细胞（见图2-D）。OS组的罗非鱼的鳃也发生病变，并且在不同患病个体中，随病情的严重程度不同其组织病理学变化也有所不同，鳃组织中出现细胞浊肿，鳃肌开始变性（见图2-E）。而阳性对照组的罗非鱼鳃叶上皮细胞及柱细胞广泛变性，大部分区域出现细胞坏死，鳃叶腔扩张（见图2-F）。

3 小结

过去10年，水产养殖在全球范围内以高于30%的速度迅猛发展，进而成为农业领域增长最快的部分之一，但鱼虾疾病的频发态势严重制约了水产养殖的快速发展。鉴此，疫苗开发、水质调控以及饲料添加剂和药物（如抗生素）等都以极快的速度应用于水产养殖领域，成为预防和控制水产动物疾病发生的有效手段。抗生素类产品已经在人类和畜禽动物的疾病预防与控制中得到广泛的使用，而抗生素类产品在水产养殖过程中的应用却出现了一些问题，这主要是与水产动物的给药方式有关。水产养殖往往采用高密度、集约化养殖模式，考虑到养殖对象的特殊性，无论预防还是治疗水产动物群体，实行个体给药都是不可行的，群体药饲和药浴成为仅有的两种备选给药方案，但这两种给药方法都可能造成抗生素给药浓度的不稳定性。这种不稳定的给药浓度变化可使鱼类长时间接触到低于治疗剂量的抗生素药物浓度，长时间持续这种状态可能导致水体和水产动物体内的病原菌产生针对某些抗生素耐药菌株。耐药菌株的存在可能对养殖者和水产养殖动物造成严重的不良后果。

植物提取物饲料添加剂由一系列的植物生物活性成分及其衍生物构成，长期以来就被当作香料、防腐剂和药材使用。精油提取物是植物源提取物的核心成分，是一类芳香、挥发性化合物的混合物，植物原料常据其芳香特征来加以区分。精油是疏水性的化合物，包括醇、醛、酯、醚、酮、酚、萜等化学成分。精油分子结构中的六碳环会在植物的生长及动物摄食的过程中生成不同的生化组分，从而产生不同的生化功能。植物提取物类饲料添加剂被认定为“安全、高效、稳定、可控”的饲料添加剂，逐渐成为绿色环保安全动物食品生产和饲料工业充满活力的新的经济增长点。

对哺乳动物的研究发现，动物胃肠道对大量的刺激都反应敏锐，这些应激可能导致肠黏膜细胞的破坏，其屏障功能受损，从而进一步影响食物的消化吸收机能。酚的抗菌效果主要是对目标细菌细胞壁结构的影响，酚类物质作用于细胞壁，改变其对H+和K+的离子通透性。研究发现，精油会抑制革兰氏阴性菌的代谢产物的活性，因为其分子很小，能够通过外膜蛋白孔，进入质膜。萜类化合物和苯基丙烯类化合物的亲脂性使其能穿过细菌的细胞膜达到细胞内部。精油还可促进消化酶的活性提高，促进脂质代谢和脂肪的消化吸收。关于植物精油的作用机制目前有几种不同的理论，比如直接减少肠道菌群、刺激乳酸菌的产生、增强体液免疫和细胞免疫机能。不论对陆生动物还是水生动物，保持其消化道健康至关重要。众多研究已证明硬骨鱼类消化道相关淋巴组织（GALT）的存在。GALT是由淋巴细胞、浆细胞、粒细胞、巨噬细胞等组成的复杂系统。可以推测，植物源添加剂和鱼类免疫功能的正常发挥有较好的协同作用，但这一作用的确切机制还需要进一步的科学研究。

本试验研究发现，经嗜水气单胞菌感染后，罗非鱼的鳃和肝脏等实质器官都发生了较严重的病变。但经过3周投喂含止痢草提取物，试验组罗非鱼的鳃和肝脏病变情况有明显缓解。如果持续数周添加，则可能恢复到正常。

17篇，刊略，需者可函索）