野生酸枣果肉几种有机酸含量分析研究

刘世鹏，曹娟云，陈宗礼

（延安大学生命科学学院，陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716000）

酸枣（Ziziphus jujuba var.spinosa）系鼠李科（Rhamnaceae）落叶灌木，广泛分布于我国北方诸省，具有养肝、宁心、安神及其敛汗的功效[1]，常用于治疗神经衰弱、心烦失眠、多梦、盗汗、易惊等疾病[2]，同时又有一定的滋补作用。现代药理学研究表明，酸枣的主要活性是齐墩果酸、熊果酸等几种五环三萜类化合物，它们具有抑菌、保肝、降脂、升白细胞、增强机体免疫力等功能，近年又证明其具有一定的抗癌活性[3]，因此受到广泛关注。

王向红等[3]对酸枣和红枣的果肉与果仁中的齐墩果酸与熊果酸进行了分析，结果表明酸枣果肉的含量明显高于红枣，而酸枣仁中几乎不含有齐墩果酸和熊果酸。最近的研究表明，不同地区的酸枣种质资源不同[4-5]，即使在同一地区差异也很大[6]。为此，本研究对几个不同产地的不同种质酸枣果肉的总酸、Vc以及齐墩果酸和熊果酸含量进行对比研究，为酸枣的充分开发利用及品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津），紫外检测器（河南兄弟仪器设备有限公司），Easy3000色谱工作站（上海千谱软件有限公司）；德国 Sartorius BP-221s电子天平（德国Sartotius公司）；超纯水制备系统:MILLI-Q Synthesis（美国MILLIPORE）；超声仪：KQ—300DE型（昆山超声仪器有限公司）；针筒式微孔滤膜过滤器（江苏百林科技，孔径0.45 μm）；PB-10型酸度计；离心机（SIGMA 3K30）等。

1.2 试剂

标准样品：齐墩果酸、熊果酸、柠檬酸购自中国药品生物制品检定所。甲醇，乙腈为美国Fisher公司产品，为色谱纯；其余试剂均为分析纯，所使用的水为去离子的双蒸馏水。

1.3 试验材料

6种酸枣材料分别采自陕西神木、陕西安塞、山西吕梁、河北邢台和山东烟台。其中采自陕西神木的两个材料外形差别较大。其主要生物学性状见表1。

1.4 样品处理

表1 6种酸枣果实的主要生物学性状

酸枣样品依次用自来水、蒸馏水、双蒸水清洗干净后，一部分风干用于总酸和Vc的测定，另一部分放45°C烘箱中烘至完全干燥后，去核，将果肉研磨粉碎成粉末状，－20°C密封保存，用作齐墩果酸和熊果酸含量的测定。

1.5 总酸与Vc的测定

采用滴定法，分别按GB/T 5009.187-2003（以柠檬酸计）[7]和何照范等[8]的方法，每个样品重复6次。

1.6 齐墩果酸和熊果酸含量测定

1.6.1 色谱条件 色谱柱：Lichrospher C18（4.6 mm×250 mm），流动相∶乙腈∶甲醇∶0.5%醋酸铵=67∶12∶21，磷酸调 pH 值为 2.8；流速：0.8 mL/min；柱温：22℃检测波长：210 nm。

1.6.2 对照品溶液的配制和标准曲线的建立 精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品适量,甲醇溶解，配成含齐墩果酸浓度为0.71 mg/mL和熊果酸0.72 mg/mL 的溶液。取齐墩果酸原液、稀释 2、5、10、20 倍，熊果酸溶液稀释 8、10、15、20、25 倍后均进样 10 μL，按1.6.1色谱条件下分析，记录色谱峰面积。

1.6.3 供试品的制备和测定 精密称取6种干燥酸枣果肉粉末各0.5 g，置于具塞试管中，精密加甲醇3.0 mL，称重,超声提取30 min，以甲醇补重，8 000 r/min离心20 min，吸取上清液以0.45 μm微孔滤膜过滤，滤过后进样20 μL。色谱条件同1.6.1。

2 结果与分析

2.1 总酸与Vc测定结果

图1、图2为6个材料的总酸与Vc含量。由图中可以看出，6个材料的总酸和Vc含量分别在0.4%～4.2%和277～631 mg/100g FW之间，均为4号最高，2号最低。除了5号与6号的总酸含量接近外，材料之间的总酸与Vc含量差异显著（p<0.05）。

图1 6个酸枣材料果肉的总酸

图2 6个酸枣材料果肉的Vc含量

2.2 齐墩果酸和熊果酸的回归方程

标准品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程：齐墩果酸：y=0.500 5 x+0.058 4，r=0.999；熊果酸：y=0.3846 x－0.008 6，r=0.995。结果表明齐墩果酸含量在0.3571～7.1429 μg、熊果酸含量在0.285 7～0.892 9 μg内线性关系良好。

2.3 精密度试验

精密吸取同一齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，连续进样6次。

齐墩果酸和熊果酸峰面积积分值的相对标准偏差（RSD）分别为7.2%和2.1%,表明仪器精密度良好。

2.4 供试液稳定性

取同一样品溶液在 0、2、4、6、8、10、12 h 分别进样20 μL,依次测定,结果6次测定齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为6.1%和1.8%。造成齐墩果酸稳定性相对较差的原因可能是由于提取液呈微酸性，在此条件下，放置时间过长会使有机酸部分发酵变质，试验结果提示供试液应及时测定。

2.5 重复性分析

精密称取同一样品6份，按供试品溶液的制备项操作，平行制备供试样品，每份进样20 μL。齐墩果酸和熊果酸各自峰面积的6次测定结果RSD分别为：4.3%和2.8%。结果表明，该方法的重复性良好。

2.6 回收率试验

取干燥样品（齐墩果酸含量为 0.54 mg/g,熊果酸的含量为0.66 mg/g）的样品6份,每份0.5 g,分别精密加入齐墩果酸对照品溶液3.0 mL，按2.2.3项下方法进行提取和含量测定。测得并计算齐墩果酸和熊果酸的平均回收率为99.88%和99.42%（表2、3），结果表明该方法准确、可靠。

表2 齐墩果酸加样回收率测定结果

表3 熊果酸加样回收率测定结果

2.7 样品测定结果

在1.6.1色谱条件下测定6个样品的齐墩果酸和熊果酸总量。结果见图3和表4。6个材料中齐墩果酸含量4号的最高，1号最低，总体在0.22～0.547 mg/g之间，而6个材料的熊果酸含量6号最高，1号最低，总体在0.280～0.645 mg/g之间。

图3 样品液相色谱图

表4 6个酸枣材料果肉的齐墩果酸和熊果酸含量（mg/g）

3 讨 论

酸枣广泛分布于中国北方诸省。酸枣因其丰富的资源、突出的适应性、显著的食疗价值，以及纯天然、富含营养等优势，近年来日益受到农业、医药、食品等行业的的关注，成为当今世界枣属植物中研究和开发利用的新宠[2]。但目前酸枣的利用主要是酸枣仁入药，而素称“Vc之王”[4]的果肉的开发和利用尚不够充分，造成了巨大的资源浪费。试验结果表明，不同种质的酸枣总酸和Vc含量差异很大，均为来自于山西吕梁的4号最高、陕西神木的2号最低。6个材料的总酸与Vc含量呈极显著正相关，这与前人的研究结果一致[4，9]，据此，在肉用或汁用酸枣资源的预选中，高酸可作为高Vc酸枣的重要预选指标。

王向红等对一种酸枣的果肉和多种不同产地红枣中的齐墩果酸与熊果酸含量进行了分析，结果表明酸枣果肉的含量明显高于所测试的其他红枣的。本研究在实验室采集的众多酸枣材料中选择了采自不同地区的6种外观等生物学形状差异明显的酸枣果肉材料，测得的6个材料中齐墩果酸和熊果酸含量在有些材料之间差异明显，但均高于红枣的[3]，由此说明，酸枣果肉具有深入开发价值。

[1] 王身艳，刘清飞，秦明珠.酸枣仁、叶、肉、根的研究进展[J].中成药，2000，（22）：794-796.

[2] 李玺乔，成 林，袁秉祥.酸枣仁软胶囊治疗神经衰弱的临床研究[J].中国实验方剂学杂志，2005，（1）：62-63.

[3] 王向红，崔 同，齐小菊，等.HPLC法测定不同品种枣及酸枣中的齐墩果酸和熊果酸[J].食品科学，2002，23（6）：137-138.

[4] 武媛林.酸枣种质资源的评价及选优[D].石家庄：河北农业大学，2008.

[5] 安锋利，杨江涛.酸枣抗旱机制研究进展[J].广东农业科学，2009，（12）：78-80.

[6] 张亚利.陕西省不同产区酸枣仁品质比较研究[D].西安：西北农林科技大学硕士论文，2007.

[7] GB/T 5009.187-2003，干果（桂元、荔枝、葡萄干、柿饼）中总酸的测定.

[8] 何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术[M].北京:中国轻工业出版社，1999.99-100.

[9] 杨 蕾.酸枣种质资源果实营养成份分析及种质评价[D].石家庄：河北农业大学，2004.