FISH技术在诊断唐氏综合征及植入前遗传学诊断中的临床应用

万均辉 钟泽艳 田佩玲 韦相才，* 张清健 李铭臻

1.南方医科大学医学遗传教研室(广州，510080);2.广东省计划生育科学技术研究所

唐氏综合征又称21－三体综合征或先天愚型，是由于生殖细胞在减数分裂过程中染色体未分离所致。目前，对于此病尚无有效的治疗手段。因此，在孕期及早、准确地做出诊断，防止患儿出生是降低患病率的重要措施。近年来，建立快速有效、简便准确、易于推广的唐氏综合征产前诊断方法是研究的热点之一［1］。传统细胞遗传学方法又称染色体核型分析是目前公认的诊断染色体异常的金标准，但受细胞培养成功率与核型质量不甚稳定的影响，该技术的普及受到一定限制。本研究探讨在染色体核型分析基础上，建立优化荧光原位杂交技术(FISH)，用于产前唐氏综合征诊断和单细胞植入前遗传学诊断(PGD)。

1 材料与方法

1.1 研究对象

外周抗凝静脉血采集于广州智灵学校;羊水标本由中山大学达安基因诊断中心提供。未受精卵、卵裂球来自本所生殖中心实验室。

1.2 主要仪器和试剂

主要仪器有荧光显微镜。主要试剂采用荷兰Kreatech混合探针，由广东友宁贸易有限公司提供(双色，X，21)。2l号和X染色体检测探针为位点特异性探针，分别用红色和绿色标记。其他试剂:①20×SSC:氯化钠175g，柠檬酸三钠88.2g，加三蒸水到1 000ml。②变性液:甲酰胺 28ml，20 × SSC 4ml，蒸馏水8ml，终体积40ml，充分混匀，调整pH至7.0～8.0，密封保存于4～8℃，每次使用前均需测定pH值。③洗脱液:甲酰胺20ml，20×SSC 4ml，蒸馏水16ml，终体积 40ml。④SSCT:20 × SSC 100ml，Tween－20 0.2ml，加双蒸水至终体积为 1 000ml。

1.3 标本收集

1.3.1 外周静脉血 外周血直接涂片，封片，备用;外周血淋巴细胞和羊水细胞培养及核型分析，按标准方法进行。

1.3.2 羊水 抽取羊水 5～6ml，1 500 rpm 离心10min，去上清，留羊水细胞沉淀，在细胞沉淀中加3ml 0.25%trypsin(溶于无 CaCl2的 Hanks液)，37℃消化30min;2 000rpm离心10min，去上清，在沉淀中加入 4 ～5ml 0.75mol/L KCl，37℃孵育 30min;加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)，轻轻混匀，2 000rpm离心10min，去上清;加5ml固定液，轻轻混匀，2 000rpm离心10min，去上清;加适量固定液，混匀静置10min，滴片。滴好的玻片浸泡在37℃的2×SSC液30min，取出浸泡在37℃的0.005%胃蛋白酶15min，然后在室温依次用70%、85%、100%的酒精脱水各2min，风干，加探针混合液，用封片胶封片，变性，杂交过夜。

1.4 标本处理

1.4.1 探针和标本共变性 在22mm×22mm区域内加入10μl探针，盖上盖玻片，放置于75℃热台上5～10min，变性。

1.4.2 杂交 放入37℃的湿盒内杂交4～20h。

1.4.3 洗脱 放入室温1× Wash Buffer II(2×SSC/0.1%Igepal)中浸泡2min，揭开去除盖玻片;在72℃的1 ×Post－Wash Buffer I(0.4 × SSC/0.3%Igepal)中浸泡2min;在室温1×Wash－Buffer II(2×SSC/0.1%Igepal)洗液中浸泡 1min;在 70%，85% 和100% 甲醇中浸泡各1 min，室温晾干;加入15μl复染液DAPI/Antifade，显微镜下观察。

1.5 未受精卵、卵裂球的FISH

1.5.1 卵子的获得 接受体外受精－胚胎移植(IVF－ET)技术治疗的患者应用控制性超排卵方案后，在常规B超引导下用17G穿刺针经阴道取卵。

1.5.2 卵子、精子的培养 采用Vitorlife公司的系列IVF培养基。卵子在体外培养4～6h(IVF－20培养液)，在含80U Hyaluronidase液中去除卵丘复合体，将出现第一极体的成熟卵移入Gamete培养液中备用。直接洗涤精液，将分离的精子放置IVF－20培养液，37℃培养箱培养备用。

1.5.3 受精与观察 采用常规或卵细胞浆内单精子注射术(ICSI)受精，次日观察。选取未受精卵、卵裂球(2C)固定在载玻片上，按常规方法处理:加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)固定好的玻片浸泡在37℃的2×SSC液30min，取出，浸泡在37℃含0.005%胃蛋白酶液体内15min，然后在室温下依次用70%、85%、100%酒精脱水各2min，风干，加探针混合液，用封片胶封片，变性，杂交过夜。

1.5.4 杂交、洗脱、显色 如前所述。

2 结果

2.1 外周血和羊水FISH结果

应用21号和X染色体特异性荧光素标记双色混合探针FISH技术检测正常羊水间期细胞作为对照:21号染色体在镜下显示为两个红色点，X染色体显示为两个绿色点，确定核型为正常女性核型(46，XX)，如图1所示。对25例唐氏综合征患儿外周血以及10例血清筛查阳性孕妇羊水间期细胞进行FISH检测:21号染色体在镜下显示为三个红色点，X染色体显示两个绿色点，核型为21三体(47，XX，+21)，如图2所示。该35例标本经核型分析确证，未出现假阴性和假阳性结果。

2.2 未受精卵、卵裂球FISH结果

应用21号和X染色体特异性荧光素标记双色混合探针FISH技术进行单个未受精卵间期细胞的PGD，显微镜下观察的FISH分析杂交信号明显、清晰、肉眼可辨。21号染色体在镜下显示为两个红色点，X染色体显示一个绿色点，确定为异常核型结构(24，X，+21)，结果如图3所示。通过对单个卵裂球间期细胞进行PGD，21号染色体在镜下显示为两个红色点，X染色体显示两个绿色点，确定为正常核型结构(46，XX)，结果如图4所示。

3 讨论

对于染色体异常的诊断，传统的细胞遗传学方法往往采用细胞培养与染色体显带分析法。由于该方法是通过羊膜腔穿刺或绒毛膜取样获得胎儿来源细胞，经体外培养后对处于中期分裂象的染色体进行核型分析，结果获取一般需要2周甚至更长时间，而孕妇长时间等待易导致心理上的焦虑和紧张，不利于胎儿的宫内发育［2］。20世纪90年代以后，随着分子生物学技术的发展以及向各学科的渗透，出现了一种新的运用分子手段分析染色体异常的方法，即染色体FISH技术，该技术不仅可用于中期分裂象，还可在间期细胞显示杂交信号，尤其适用于那些难以培养成功的各种组织细胞(羊水、绒毛、外周血等)，并且大大缩短了产前诊断的时间。FISH方法是将DNA探针用不同颜色荧光染料标记，与固定在玻片上的卵裂球细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光，从而对染色体异常进行筛查。目前在部分发达国家已将FISH诊断染色体数目异常作为了一项常规手段［3］，国内研究人员也进行了很多有益的尝试［4］。

本研究在参考国内外多种方法的基础上，利用荧光素标记的双色混合探针直接对唐氏综合征进行FISH分析，并建立了一套稳定的FISH方法。经过染色体核型确证，具有较高的符合率(100%)，与国外的符合率一致［5，6］。FISH与常规染色体显带分析法相比，有如下优点:用材少、快速(24h内可出结果)、不需体外培养、在极短时间内可检测大量细胞;可对分散不好的分裂象做出明确诊断;能分析一部分显带染色体技术不易分辨的异常［7］，如复杂易位、倒位、微小缺失、复杂畸变等;敏感性和特异性高［8～11］。因此，FISH技术可应用于未经培养的分裂期和间期细胞中染色体异常的分析。而间期细胞获得容易，细胞数量多而使分析的细胞数目也相应的增多，这是FISH技术最大的优势。由于FISH探针试剂的价格昂贵，极大地限制了它在临床上的应用。本研究中FISH检测全部采用的Kreatech混合探针，价钱相对比较低廉，节约了成本。本研究所应用的双色FISH检测，均未出现假阳性和假阴性结果，与传统的细胞染色体核型分析结果一致;技术方法上更简单、经济，达到了检测染色体异常的目的。同时，本研究对FISH实验成本进行了优化，在研究过程中尝试调整杂交液用量，将杂交液的用量减少，使得同样的试剂可以应用到更多的标本上，对杂交效果没有显示出影响。研究结果显示优化的实验方案提高了快速检出效能并且明显降低了成本，为下一步大规模应用于临床打下基础。

胚胎PGD是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎活检卵裂胚胎细胞，进行植入前遗传学分析，以选择正常的胚胎移植回母体子宫，获得正常胎儿的诊断方法，可有效地防止有遗传疾病的患儿出生［3，12］。PGD 是随着人类辅助生殖技术，即IVF－ET技术发展而开展起来的一种新技术，是产前诊断的延伸，是遗传学诊断的又一更有应用前景的新技术。对高龄孕妇和高危妇女进行PGD可以有效地避免遗传病患儿的出生，可对异常胚胎进行治疗性流产，避免中期妊娠遗传诊断及终止妊娠所致的危险及痛苦［13］。PGD可从胚胎着床前各个阶段活检取样，缩短了产前诊断的时效性，同时也避免了选择性流产和多次流产可能造成的危害以及与伦理道德观念的冲突。

通过FISH技术采用多种探针可诊断男、女性别和性连锁疾病，也可诊断染色体疾病，包括数目和结构的畸变［14，15］。所以 FISH 技术的应用扩大了PGD的诊断范围，特别是间期单核细胞FISH技术的成功，以及多种多样FISH探针的开发，把PGD扩展到了染色体病的诊断。如FISH技术在PGD中的应用解决了胚胎性别的鉴定，排除性连锁疾病的发生。如对于X连锁隐性遗传病，通过FISH技术鉴定性别，防止后代相应遗传病的发生。同时，通过选择正常和平衡配子或胚胎，PGD可显著降低染色体易位导致的反复自然流产率，这是其他产前诊断无法比拟的。本研究探讨FISH方法，对未成熟卵、未受精卵进行FISH杂交，结果与染色体核型分析一致，获得良好的结果。如采用单细胞快速制备中期染色体的方法，结合多种FISH技术，如多重杂交FISH技术、光谱核型分析、比较基因组杂交等，将大大地提高PGD检测的准确性和有效性。因此，FISH技术对于产前诊断唐氏综合征及PGD，具有重要的临床应用价值，是一种有前景的遗传病产前诊断方法。

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