四种植物蛋白源及其不同添加水平对异育银鲫肠道组织结构的影响

王永玲 王文娟 宋 霖 蔡春芳 叶元土 孔 丽

鱼粉是一种理想的动物蛋白源，是水产动物最重要的饲料原料。然而全球鱼粉资源正日渐衰退，大量使用鱼粉对环境的负面影响也较大（Cowey等，1991），因此应该限制鱼粉用量，寻找水产饲料中鱼粉的适宜替代品。

植物蛋白源资源丰富，用植物蛋白源替代鱼粉的研究报道也很多。许多研究表明，豆粕替代鱼粉后会引起鱼类肠道形态结构的改变，使鱼易患类似非感染性肠炎。而关于鲤鱼（Uran等,2008）、鲫鱼（张伟等，2010）的研究表明，这种肠道形态的变化在摄食3周后会消失。肠道是直接接触饲料并且敏感的器官，因此，其形态结构及功能变化可用于评判饲料优劣。本研究以异育银鲫肠道为靶器官，研究豆粕、花生粕、菜籽粕、棉籽粕四种植物蛋白源及其不同比例替代鱼粉饲养不同时间后肠道形态的变化，以评价四种植物性饲料蛋白源对异育银鲫的适用性，为实用配方设计提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

参照异育银鲫实用饲料配方，以白鱼粉为主要蛋白源，鱼油和豆油为主要脂肪源配制基础饲料（FM）作为对照组。选用豆粕（SBM）、花生粕（PM）、菜籽粕（RM）、棉籽粕（CM）四种植物蛋白源分别替代25%和50%的鱼粉，配制成8种试验饲料。饲料配方及营养成分见表1。

1.2 试验鱼及分组

表1 试验日粮配方及营养成分

异育银鲫购自江苏溧阳，为当年池塘养殖鱼种。经一周驯养适应环境后，选取大小均匀、体格健壮，约25 g的鱼种，随机分配到27个70 cm×80 cm×100 cm的玻璃钢水族箱中，每箱20尾。各试验组按完全随机化配置法分布以避免位置的差异造成的试验误差。

1.3 饲养管理

每种饲料投喂3箱鲫鱼，每天投喂量视鱼的摄食情况而定，适量投喂，投喂时间分别为8：30、12：30、17：00。详细记录每天的摄食量。所有水族箱在同一半开放式循环养殖系统中，自然光周期，以充分曝气的自来水为水源，每天换水量为总水量的1/3。养殖水经过滤、沉淀后流回蓄水池，经过增氧、控温后由水泵抽回各水族箱。养殖期间水质条件为：水温(25±2)℃，DO＞6.0 mg/l，pH 值 7.5±0.2，NH3-N 浓度为(0.25±0.05)mg/l，NO2-N 浓度为(0.04±0.01)mg/l，硫化物＜0.05 mg/l，各项指标均符合养殖水体要求。饲养期自2010年8月25日至2010年10月24日，共进行8周。

1.4 采样与分析方法

分别于2周、3周、5周、8周末从各水族箱随机取试验鱼3尾，使用MS-222将鱼麻醉。取出内脏，分离出肠道，剔除表面脂肪组织，分别取前肠和后肠组织在生理盐水中洗涤，除去其上所带有的血液、粪便等杂质，放入波恩氏液中固定。制样时将其取出，分别经浓度为70%、80%、90%、95%和100%的乙醇梯度脱水，并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔点石蜡中。使用KD-2508型切片机横向连续切片，厚度为6 μm，而后展片于清洁的载玻片上，采用H.E染色，中性树胶封片。光镜观察皱襞（F）高度、黏膜（S）下层和肌层（M）厚度，以及柱状上皮细胞内淋巴细胞浸润度。

1.5 数据处理

试验结果采用“平均值±标准差”表示，所有统计分析采用SPSS 16.0软件，数据经方差分析后用Duncan's法多重比较，显著水平为0.05。

2 试验结果(见图1及表2～表5)

图1 黏膜下层富含淋巴细胞的区域为淋巴细胞层

表2 试验饲料投喂2周后异育银鲫前肠、后肠组织形态（μm）

表3 试验饲料投喂3周后异育银鲫前肠、后肠组织形态（μm）

表4 试验饲料投喂5周后异育银鲫前肠、后肠组织形态（μm）

表5 试验饲料投喂8周后异育银鲫前肠、后肠组织形态（μm）

光镜分析可见，异育银鲫肠道皱襞由前向后逐渐缩短，肌层由前向后逐渐变薄；黏膜下层富含淋巴细胞的区域为淋巴细胞层（见图1）。2周和3周时，肌层厚度各组间前、后肠均无显著差异（表 3）；5周时，SBM50组、RM 组前、后肠肌层厚度均显著低于FM组(P＜0.05)；8周时，SBM50组、RM组、CM50组前、后肠肌层厚度均显著低于FM、SBM25和PM25 组(P＜0.05)。

2周和3周时，皱襞高度各组间前、后肠均无显著差异(P＞0.05)；5周时，CM50组前肠显著低于FM组(P＜0.05)，后肠各组差异均不显著(P＞0.05)；8 周时，各组间前肠、后肠差异均不显著。

黏膜下层厚度各组间无显著差异。

5周时，上皮内淋巴细胞浸润度SBM50前肠上皮内淋巴细胞大大高于FM组，RM组和CM50组后肠上皮内淋巴细胞也有增多，8周时，RM25、RM50和CM50组后肠上皮内淋巴细胞量高于FM组。

3 讨论

鱼类肠道是营养物质消化吸收的主要场所，黏膜皱襞的高低和疏密、上皮细胞的高低、纹状缘的发达程度以及杯状细胞数量的多少等与消化吸收能力密切相关（娄允东，2000）。Burrells等（1999）研究表明，豆粕中的抗营养因子可导致大西洋鲑和虹鳟肠黏膜发生病理变化和非特异性免疫能力下降。Pongmaneerat等（1992）研究表明，饲料中豆类产品添加量超过50%即可导致虹鳟肠黏膜损伤加大、液泡种类和数量上升、亚黏膜炎症反应的增加。Refstie S等(2001)、Ksudhik等(2004)分别在虹鳟、欧洲真鲈的饲料中添加一定量的大豆蛋白，发现后肠绒毛上皮结构发生形态变化，黏膜褶缩短、黏膜固有层加深加宽。但有关菜粕、棉粕、花生粕对肠道影响的研究较少。本试验中，异育银鲫日粮中添加植物蛋白源后，随着饲养周期的延长，各种植物蛋白源均在一定程度上对异育银鲫的肠道结构产生影响，特别是高含量组。其中，尤以棉籽粕和菜籽粕造成的影响较大，豆粕和花生粕次之。结果提示我们，各种植物蛋白源在鲫鱼饲料中适宜添加量的研究除了要考评生长效果外，还应考察其生理影响。有些植物蛋白源即使对生长没产生显著影响，也可能使鱼类处于亚健康状态，最终影响养殖效果。本试验结果表明，豆粕和花生粕是鲫鱼较好的植物蛋白源，棉籽粕和菜籽粕次之。异育银鲫日粮中，菜籽粕在配方中的比例不宜超过25%。豆粕、棉粕和花生粕作为单一植物蛋白源添加时，在配方中的比例不宜占到50%。

Uran等（2008）报道，当饲料中20%的蛋白质由动物蛋白变为豆粕时，鲤鱼摄食1周后即表现出肠炎症状，而在3周时症状比较严重，表现出了皱襞缩短、上皮细胞核上空泡消失、杯状细胞数量增加、固有层变宽、黏膜下层嗜碱性粒细胞增加、下皮细胞吞噬能力下降等症状。但在第4～5周时就观察到自行恢复现象。张伟等（2010）也观察到鲫鱼摄食含30%豆粕的饲料后3周出现明显的肠道形态变化，但8周时症状消失。本试验中未在3周时观察到鲫鱼肠道形态学变化，但在5周后观察到不同处理间有显著差异。植物蛋白源对肠道形态影响的作用规律和机制还有待进一步研究。

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