米尔贝肟对感染性犬蛔虫卵作用的试验研究*

曲明丽,李继昌

犬蛔虫是犬体内广泛存在的寄生虫,也是引起人蛔虫病的主要原因,在许多国家造成严重的流行病学问题。儿童和成年人能意外吞食犬蛔虫卵而感染。犬蛔虫幼虫可在人体或动物体内长期迁移,发生内脏移行症和眼蛔虫病[1]。米尔贝肟(milbemycin oxime)是由日本Sankyo公司于1973年从链霉菌属(Strep to myces hygroscopicus)中分离得到的一类具有广谱杀虫活性的十六元大环内酯结构的天然产物[2],为由米尔贝霉素A 3肟和米尔贝霉素A 4肟按2∶8比例组成的混合物[3]。该药是目前防治犬、猫体内外寄生虫的特效药,能特效防治恶心丝虫,高效防治蛔虫、钩虫、原虫、鞭虫等体内寄生虫,以及毛囊虫、疥癣、虱、跳蚤等体外寄生虫[4]。1997年,我国台湾地区推出诺华生产的倍脉心(成分为milbemycin oxime),作为犬猫预防心丝虫与肠内寄生虫内服药,是米尔贝肟首次在国内应用。由于专利限制,从上世纪八十年代发现至今,中国大陆一直没有研究和应用,随着专利到期,米尔贝肟作为一种新型抗体内外寄生虫药越来越受到重视,为评价该药对蛔虫病的防治作用,指导临床合理用药,本文进行了其对感染性犬蛔虫卵的作用试验。

1 材料与方法

1.1 试验动物 用于分离犬蛔虫的犬小肠购自哈尔滨市香坊区成高子屠宰场,屠宰的犬为本地杂种犬;健康昆明种小鼠,购于黑龙江省肿瘤医院实验动物中心。

1.2 受试药物 米尔贝肟原料药,白色结晶性粉末,含量≥98%,4℃避光保存,由浙江海正药业股份有限公司提供,临用时用二甲基亚砜配制成适当浓度的溶液。

1.3 试验方法

1.3.1 雌性犬蛔虫成虫的获取[5]将幽门和盲肠的瓣膜并夹紧后,把小肠分离并放入盛有pH7.0磷酸盐缓冲生理盐水(PBS,37℃)的广口瓶中保存。纵切小肠,用镊子取出蛔虫成虫,并放入37℃含有1.0%甲醛的pH7.0PBS(FS)中清洗,至少 3次,每次2min。选取14cm左右的雌性犬蛔虫放在含有2%葡萄糖和1%牛血清的pH7.0PBS中,37℃CO2培养箱中培养。

1.3.2 犬蛔虫卵的收集[6]将雌性犬蛔虫每24h转移到一个新培养瓶中,并收集犬蛔虫卵,直到虫体衰竭。所获得的犬蛔虫卵经1500r/min离心5min,清洗后,放入含1.0%甲醛的pH7.0PBS中,29℃温箱中培养。2周后显微镜下观察犬蛔虫卵形态,如果犬蛔虫卵形态正常并且卵内已形成幼虫,并且卵内幼虫活动,即可判定犬蛔虫卵已发育成感染性犬蛔虫卵。

1.3.3 感染性犬蛔虫卵的活性测试[7]在正式实验前,对所获得的感染性犬蛔虫卵进行活性检测。将感染性犬蛔虫卵感染5只小白鼠(1000个/只),感染第7d,解剖小鼠,在90%的小白鼠肺部检出幼虫,据此结果,判定感染性犬蛔虫卵具有活性,可用于动物体感染。

1.3.4 不同浓度的药液与感染性犬蛔虫卵作用的时间 将感染性犬蛔虫卵浓缩为1000个/0.5mL。将配好的不同浓度药液分别与感染性犬蛔虫卵液混合使其终浓度分别为 10-5、10-6、10-7g/mL,作用时间分别为 12、24、48h。

1.3.5 动物分组及感染 小鼠在洁净净化隔离室内饲养,使用高压灭菌垫料和购入包装饲料,饮水无限制。正常饲养1周后,挑取健康者进行实验。将小白鼠分成11组,每组10只。其中9组分别感染与不同药物浓度作用的感染性犬蛔虫卵溶液;1组为空白对照组(只灌服有 1.0%甲醛的 pH7.0 PBS),另1组为阳性感染组(只灌服感染性蛔虫卵)。小鼠感染前均禁食12h,可进水。次日晨进行灌胃感染,剂量均为每只小鼠1000个卵/0.5mL。在感染后的3d、5d分别进行解剖,观察肺脏的损害情况,并做脏器的病理组织学观察。

2 结 果

2.1 肺脏的肉眼观察结果 阳性感染组中的小鼠肺脏出现红色肝样变和大面积出血两种典型的症状。药物实验组在感染3d后,灌服低浓度药物(10-7g/mL)作用12h的感染性犬蛔虫卵的小鼠,其肺脏有很多出血点。但此浓度作用24、48h,小鼠肺脏观察无病变。灌服高浓度药物(10-5g/mL)作用12h的感染性犬蛔虫卵的小鼠,其肺脏观察正常。在感染5d后,低浓度药物(10-7g/mL)与感染性犬蛔虫卵作用时间12h,小鼠的肺脏出血点增多。但作用24h后,小鼠肺脏正常。其它药物实验组的小鼠肺脏均无病变。

2.2 肺脏的病理组织学检查结果 小鼠肺脏的病理组织学变化见图1(图1)。阳性感染组(图1.2),与空白对照组(图1.1)比较,肺泡腔萎缩,散在大量血细胞。血管和细支气管处有炎细胞浸润并伴有红细胞。感染3d后,灌服10-7g/mL米尔贝肟作用12h感染性犬蛔虫卵的小鼠,其肺脏出现明显病变,即血管和细支气管处有炎性细胞浸润并伴有红细胞(图1.3);灌服此浓度药液作用24h、48h感染性犬蛔虫卵的小鼠,其肺脏的病变轻微,甚至无病变。10-5、10-6g/mL米尔贝肟无论与感染性犬虫卵作用时间长短,感染其小鼠的肺脏病变轻微,甚至无病变(图1.4)。

小鼠感染5d后,灌服10-7g/mL药液作用12h感染性犬蛔虫卵的小鼠,其肺脏病变严重,即支气管和肺泡腔内有大量血细胞或嗜酸性深染物质(图1.5)。随着两者作用时间的加长(24h、48h),感染其小鼠的肺脏病变减轻,甚至无病变(图1.6)。

3 讨 论

犬蛔虫卵在犬体内会发生内脏幼虫移症,即犬直接吞食感染性犬蛔虫卵,在犬的小肠内孵化成幼虫,幼虫钻入肠壁、经淋巴系统到肠系膜淋巴结,然后经血液到达肝脏,再随血液到肺脏,感染后的第5d,肺中的幼虫到达高峰,幼虫经肺泡、细支气管、支气管、气管到达咽部,再被咽入胃,到小肠后进一步发育为成虫。蛔虫幼虫在犬体内移行过程中,损伤肠壁、肺毛细血管及肺泡壁。

从米尔贝肟对感染性犬蛔虫卵的体内试验结果看,无论小鼠感染3d后还是5d后剖检,也不论药物与感染性犬蛔虫卵作用多长时间,肺脏的病变程度都随着药物浓度的增高而减弱,说明高浓度(10-5、10-6g/mL)米尔贝肟可明显影响感染性犬蛔虫卵对小鼠的感染程度。

小鼠感染3d后,从其剖检的肺脏来看,同一浓度的药物与感染性犬蛔虫卵作用时间越长,肺脏的损害越轻微。这可认为药物与感染性犬蛔虫卵作用时间越长,感染性犬蛔虫卵的感染性越弱,从而引起小鼠肺脏病变就越轻微,即药物与感染性犬蛔虫卵作用48h,小鼠感染高浓度(10-5、10-6g/mL)药物作用的感染性犬蛔虫卵后,其肺脏几乎正常。低浓度药物(10-7g/mL)仅引起极轻微的红色肝样变。小鼠感染5d后,阳性感染组的小鼠肺脏病变相当严重,与用药组相比较,小鼠肺脏病变轻微。其病变规律同上。

图1 小鼠肺脏病理组织学的变化Fig.1 Histopathologic changes of the lungs ofmice

综上所述,高药物浓度(10-5g/m L)无论与感染性犬蛔虫卵作用多久,都会使感染性犬蛔虫卵失去感染性,使感染性犬蛔虫卵无法移行到肺脏,对肺脏造成损害。低药物浓度(10-7g/m L)虽不能完全抑制感染性犬蛔虫卵的活性,但与阳性对照比较,也能致使部分感染性犬蛔虫卵失活,以致肺脏损伤不严重。当药物浓度为10-6g/m L时,与感染性犬蛔虫卵作用24h后,即可达到高浓度(10-5g/m L)药物同样的效果。所以,米尔贝肟对感染性犬蛔虫卵有很好的灭活作用。

[1]Kerr-Muir MG.Toxocara canis and human health[J].BMJ 1994,309:5-6.

[2]Takiguchi Y,Mishima H,Okuda M.A new family ofmacrolide antibodies:fermentation,isolation and physico-chemical properties[J].JAntibiot,1980,33:1120-1127.

[3]Bater AK.Efficacy of oralmilbemy cin against natu rally acquired heartwormin fection in dogs[C].Proceedings of the Heartworm Symposium'89,Charleston,South Carolina,1989:17-19.

[4]Mckellar Q A,Ben chaoui H A.Aver mectins and milbemycins[J].Jou rnal of Veterinary Pharmcology and Therapeutics.1996,19:331-351.

[5]Ponce-Macotela M,Peralta-AbarcaGE,Martnez-Gordillo MN.Giardia intestinalisand other zoonotic parasites:prevalence in adult dogs from the sou thern part of Mexico City[J].Vet Parasitol.2005,131:1 4.

[6]Caballero A R,Luna-Ochoa R I,Ponce-Macotela M,et al.A simple and inexpensive in vitro method for retrieving fertilized Toxocara canis eggs[J].Parasitol Res,2007,101:829 832.

[7]邱琳.两种基因型蛔虫在小鼠体内的移行和分布[D].南昌大学硕士学位论文,2007:12.