酶联免疫吸附法、甲苯胺红不加热血清试验、明胶颗粒凝集法检测梅毒血清抗体比较

王娴，黄潇苇，曾着黎，牟皎，程莉惠

（1.成都市第三人民医院检验科，四川 成都 610031；2.川北医学院医学检验系2006级，四川 南充 637000）

梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）不能在体外 培养，只能在活体内繁殖，而且主要对兔睾丸和眼前房敏感。因此，检测病原体只能直接在病灶中采集标本后立即做暗视野显微镜观察（R－F），因为成本、操作复杂和检测时效等原因，除研究外，一般不做R－F和兔睾丸感染试验（RIT）。根据TP感染机体后特殊的免疫反应规律，梅毒检测方法主要是针对非特异性抗体和特异性抗体的血清学检测，如梅毒甲苯胺红不加热血清试验（toluidine red unheated serum test，TRUST）、梅毒螺旋体抗体诊断试剂（凝集法）（treponema pallidum particle agglutination assay，TP－PA）、梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（双抗原夹心酶联免疫吸附法）（treponema pallidum enzyme linked immunosorbent assay，TP－ELISA）。现在有少数实验室在用PCR技术检测TP－DNA和采用梅毒抗体蛋白印迹法（Western－blot）检测TP特征蛋白条带，但是一般都是做研究［1］。我们采用TP－ELISA和TRUST两种方法同时对临床14 307例血清标本进行初筛，对TP－ELISA与TRUST结果不符的标本及ELISA法S／CO值在0.70～0.99的标本用TP－PA检测，并将结果进行比较分析，以期为临床梅毒检测方法的选择提供参考。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 研究对象

14 307例血清标本来自2010年9月～2011年5月在我院申请梅毒血清检测的临床各科室住院及门诊所有标本。

1.2 标本收集

住院患者入院当天或者第2天，于清晨空腹抽取静脉血3mL，置于未加抗凝剂的采血管中，3000r／min下离心5min，分离血清待测。门诊患者申请梅毒血清检测后于清晨空腹抽取静脉血3mL，标本处理程序同前。

1.3 仪器与试剂

瑞士澳斯邦AT机（AT Plus2 2757）全自动加样仪；瑞士FAME全自动酶免疫分析仪。TP－ELISA诊断试剂盒（北京万泰生物公司）；TRUST试剂（上海荣盛生物药业有公司）；TP－PA诊断试剂（日本富士锐必欧株式会社）。质控品：批号：200907003；有效期：201107（北京康彻思坦生物有限公司）。

1.4 检测方法

14 307份血液标本中同时用TP－ELISA法和TRUST进行梅毒初筛，对TP－ELISA与TRUST结果不符的标本及TP－ELISA法S／CO值在0.70～0.99的标本用 TP－PA 检测［2］。所有检测方法操作和实验条件与试剂说明书保持一致，质控品用ELISA法测定均在控。

1.5 统计学方法

分别统计TP－ELISA和TRUST的阳性检出率、TRUST的漏检率及TP－ELISA的假阳性率。对TP－ELISA初筛S／CO值在0.70～0.99的标本统计 TP－ELISA的假阴性率。

2 结果

14 307例血清标本筛查出203例TP－ELISA阳性。203例TP－ELISA中115例TRUST阳性，88例TRUST阴性。TP－ELISA阳性检出率为1.42%（203／14 307），TRUST 的阳性检出率为0.80%（115／14 307），TRUST 的漏检率为43.35%（88／203）（表1）。TP－ELISA 阳性 TRUST 阴性的标本88例，进一步做TP－PA，其中1例阴性，TP－ELISA的假阳性率为0.49%（1／203）。该例患者87岁，为骨科收治患者（临床诊断为颈椎病，基础疾病有糖尿病、高血压）；其两次不同时间抽血检测结果均为TP－ELISA阳性，S／CO值分别为5.361和3.109，但 TRUST和 TP－PA均阴性。

表1 TP－ELISA与TRUST初筛检测结果Tab.1 Results of TP－ELISA and TRUST

对 TP－ELISA 初 筛 S／CO 值 在 0.70～0.99 同 时TRUST均为阴性的23例标本，做TP－PA检测，检出阳性2例，阴性21例，TP－ELISA的假阴性率为8.70%（2／23）。

3 讨论

机体感染梅毒螺旋体后可产生特异性抗梅毒螺旋体抗体（TP－Ab）和非特异性抗类脂质抗体。梅毒特异性抗体出现早、消失迟，即便经过正规抗梅毒治疗，仍可检出其特异性抗体，甚至可终生检出。非特异性抗体出现迟、消失早，在一期梅毒早期、三期梅毒、晚期潜伏梅毒及治疗后梅毒出现假阴性。目前用于检测这两种抗体的方法有性病研究实验室试验（VDRL）、不加热血清反应素试验（USR）、快速血浆反应素 试 验 （RPR）、TRUST、TP－ELISA、梅 毒 胶 体 金 法（SYP）、荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA－ABS）、梅毒螺旋体血凝试验（TP－HA）、TP－PA、梅毒螺旋体制动试验（TPI）等10种，但临床检验室较常用的是TP－ELISA、TRUST、RPR及TP－PA［2］。由于检验方法较多，各种方法又有其特殊的临床应用价值，如何更合理地选用这些方法应用于临床梅毒检测是临床实验室需要解决的问题。为制定出适合本院的梅毒检测方案，结合本组所得数据，我们对本院使用的3种梅毒血清学检测方法进行了综合评估。

TP－ELISA的原理为利用基因重组工程合成抗原，检测血清中的梅毒特异性抗体，在梅毒的潜伏期即产生，约在感染后2周，对梅毒的早期辅助诊断较好［3］。ELISA试剂成本低，操作方便，可使用全自动或半自动酶标仪，原始数据易于保存，是大批量标本梅毒筛查的理想方法。但是该法检测的是梅毒IgM和IgG的混合抗体，梅毒IgG抗体治愈后相当长的时间内仍然存在较高的阳性率，甚至终身阳性，因此，TPELISA阳性只说明正在感染或曾经感染过，不能判断梅毒疾病活动与否，所以不能作为疗效监测手段，故对梅毒的诊断必须结合临床表现，否则可能导致临床误诊，并增加患者的心理负担。本组结果中TP－ELISA的阳性检出率为1.42%，与易海清等［4］报道的1.6%相似；TP－ELISA 与 TP－PA 符合率较高，达98.86%（87／88），但仍然存在一定的假阳性率与假阴性率。分析假阳性的原因，可能与血清中纤维蛋白有关，研究表明自身免疫病、疟疾、新近免疫接种、皮肤病、心血管病、结核、麻风、静脉注射毒品、病毒感染、热性病可导致TP－ELISA试验假阳性［5］，而一些患者的基础疾病可能使机体释放诱导产生抗类脂抗体或抗TP抗体的交叉抗原引起假阳性［6］，此外，目前TP－ELISA试剂盒均未配置吸收稀释剂，待测血清均未用吸收剂吸除与非梅毒螺旋体交叉反应的抗体［7］；假阴性的原因则可能与ELISA所用包被抗原和标记抗原的成分的纯度、效价和抗原的种类有关，研究表明单一基因重组抗原比多种基因重组抗原联合用于ELISA检测梅毒的灵敏度低［8，9］。综合考虑，我们认为，TP－ELISA 适合血站献血者筛查、医院大批量体检和大、中型医院实验室对梅毒感染的早期检查，但其检查结果应结合TRUST以观察疗效和TP－PA以排除假阳性、假阴性。

TRUST法的检测原理是采用牛心磷脂作为抗原检测非特异性抗体，在一期梅毒早期，三期梅毒，晚期潜伏梅毒及治疗后梅毒可出现假阴性［10］。本次实验TRUST的阳性检出率为0.80%（115／14 307），漏检率43.35%（88／203），与栗艳等［11］报道的45.30%相似，表明TRUST法存在假阴性。据报道，TRUST在一、二期梅毒的检出率高达96%～100%［12］，但在一期梅毒潜伏期及晚期梅毒的检出率较低，仅58%～85%［13，14］，同时受一些其他因素干扰，如疟疾、类风湿性节炎、SLE等疾病，TRUST法可出现假阳性［5］。这些数据表明，TRUST法容易造成漏检，特别是对早期梅毒的辅助诊断能力差，因此不适合用于早期梅毒的辅助诊断；但该方法操作简便，试剂价格便宜，反应快，不需要特殊仪器设备，方便测定抗体滴度，其滴度变化与梅毒的治疗情况呈正相关，适合用于疗效观察、随访和复发的辅助诊断以及基层医院应用，在临床发挥着不可替代的作用［15］。

TP－PA的原理为利用梅毒螺旋体毒株制成Ag，检测特异性抗体。其灵敏度与TP－ELISA接近，但其特异性比TPELISA高，能够排除TP－ELISA的假阳性和假阴性，是临床常用的梅毒确诊试验。TP－PA试剂稳定、操作简单、不需要专门仪器、结果可靠，与ELISA之间的一致性高，但试剂较贵，检测时需将标本作系列稀释，不利于大批量标本检测，且以肉眼判断结果，原始数据无法保存。该法检测的同样是梅毒IgM和IgG的混合抗体，存在着与TP－ELISA类似问题，因此适合用于前两种方法测定阳性后的确诊试验，以及排除TP－ELISA检测中假阴性者。

鉴于 RP－ELISA、TRUST、TP－PA 三种方法各有优缺点，我们认为可制定梅毒血清学检测流程，以利于最大程度提高检出率，同时降低成本和漏检率。流程如下：（1）对临床住院及门诊申请做TP检查的标本同时做TP－ELISA和TRUST初筛，对TP－ELISA与TRUST结果相符的标本则直接出TP－ELISA与TRUST结果报告。对TP－ELISA与TRUST结果不符的标本进一步做TP－PA检测；（2）对于TP－ELISA法初筛S／CO值在0.70～0.99之间同时TRUST为阴性的血清标本，进行TP－PA复检，以排除假阴性。

但本组观察也存在较多不足与缺陷：（1）本组观察是对具体检测工作的总结，并未严格控制实验条件如温度、湿度等，存在不严谨之处。（2）进行大样本量的比较评价时，先采用TP－ELISA法及TRUST初筛，然后对初筛结果不符的标本才进行TP－PA的检测，没有做到同步盲法，这种情况不能真实反映方法对人群整体检测能力，评估欠全面。（3）梅毒检测公认金标准为荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA－ABS），而本次试验是以TP－PA为确证试验，对可疑或不确定的标本没有进一步确认。（4）循环比较，即用被评价方法TPELISA本身作为标准与TRUST及TP－PA比较，无法确定实验方法敏感性、特异性、Youden′s指数以及方法间的一致性。（5）鉴于TP－ELISA法初筛S／CO值在0.70～0.99之间同时TRUST为阴性的血清标本量仅为23例，因此关于TPELISA的假阴性率还有待做大批量统计进一步进行论证。

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