薤白抗菌物质的提取工艺

张传军，刘 超，姜晓坤

薤白抗菌物质的提取工艺

张传军，刘 超，姜晓坤

(吉林农业科技学院食品工程学院，吉林 吉林 132101)

为优化薤白中抗菌物质的提取工艺条件，采用单因素试验和响应面分析方法，以水为提取剂，以金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为响应值，确定最佳的薤白抗菌物质的水浸提条件：加水量为薤白浆液体积的2倍，32℃提取4次，每次3h。此条件下得到的抗菌物质抗菌性较好，进行金黄色葡萄球菌的抑菌实验，得到抑菌圈直径达到13.98mm。证明薤白具有抑菌活性，所提取的抗菌物质可以作为天然食品防腐剂。

薤白；抗菌物质；提取

薤白(Allium macrostemon Bunge)为百合科葱属多年生草本植物，又名“野蒜”、“小蒜”，是一种安全、无毒的食用野菜，在我国大部分省份均有分布。其鳞茎上屉蒸至半熟后晒干或烘干入药称作薤白。薤白中含有多种生物活性成分[1]，可通阳开痹、温中理气、健胃整肠，并具有抗菌消炎的作用。用该属植物制备的天然保鲜剂进行蔬菜保鲜已有报道，如张恒[2-3]用大蒜提取物保鲜蔬菜，王展华[4]采用洋葱精油对马铃薯、莲藕进行保鲜研究，均取得了较好的效果，但以薤白为原料制备保鲜剂尚未见报道。据报道[6-8]薤白具有广谱的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌等细菌及根霉、木霉、曲霉、酵母菌等真菌都显示出良好的抑制作用，而且具有较好的热稳定性[9-10]。为此，本研究选择具有抑菌防腐作用的野生药食同源植物薤白为材料制备天然保鲜剂，全面系统地研究薤白的抑菌活性，以期为开发纯天然、无污染的植物源防腐剂提供依据。

1材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

薤白于7月中旬采自吉林市左家镇山区。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌由吉林农业科技学院微生物实验室提供；培养基：牛肉膏-蛋白胨培养基；所用试剂均为分析纯。

DH300电热恒温培养箱、BS-1E数显全温振荡培养箱 常州华普达仪器制造厂；LDZX-50KBS自动控制不锈钢立式压力蒸汽灭菌锅 上海茸研仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水浸提工艺确定

1.2.1.1 薤白预处理[11]

将新鲜薤白洗净，用75%酒精消毒后切段，用组织捣碎机打成匀浆后备用。

1.2.1.2 薤白水提液的制备

水是一种强的极性溶剂，薤白中亲水性的抗菌成分能被水溶出。为有效提取薤白的抗菌物质，可将薤白的水提液浓缩至一定体积后，向其中加入95%的乙醇，使乙醇体积分数达到75%，静置24h，过滤去除杂蛋白，滤液浓缩，得到薤白水提液。

采用单因素试验考察不同加水量、提取时间、提取次数、浸提温度对薤白抗菌物质的得率及抗菌性的影响。

1.2.1.3 加水量的确定

精确称取5份薤白各20g，打浆，在20℃，分别加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0倍量(V/V)薤白的蒸馏水提取3次，提取时间3h，重复3次。水提液浓缩至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根据抗菌能力的结果确定加水量。

1.2.1.4 提取时间的确定

在加水量确定的条件下，精确称取5份薤白各20g，打浆，在20℃加入蒸馏水进行提取，提取时间分别为0.5、1.0、2.0、3.0h和4.0h。水提液浓缩至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根据抗菌能力的结果确定提取时间。

1.2.1.5 提取次数的确定

在加水量及提取时间确定的条件下，精确称取4份薤白各20g，在20℃加入蒸馏水，分别提取1、2、3、4次。水提液浓缩至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根据抗菌能力的结果确定提取次数。

1.2.1.6 提取温度的确定

在加水量及提取时间确定的条件下，精确称取5份薤白各20g，加入蒸馏水，分别在15、20、25、30、35℃，提取3次。水提液浓缩至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根据抗菌能力的结果确定最佳提取温度。

1.2.2 抑菌实验

1.2.2.1 菌种活化

细菌接入对应的斜面培养基上进行活化，置37℃恒温培养箱中培养24h。

1.2.2.2 菌悬液或孢子悬液的制备

在无菌条件下，用接种环挑取活化后的菌体或孢子，放入50mL无菌生理盐水中振荡摇匀，制成菌悬液或孢子悬液。

1.2.2.3 抗菌效力的测定[1,12-14]

用打孔器将定性滤纸加工成直径10mm圆形滤纸片放入干燥平皿中，于121℃干热灭菌20min，冷却后放入薤白水浸提液中浸泡10min，于无菌操作台上晾干。配制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌固体培养基，121℃湿热灭菌30min，冷却后倒平板。在无菌条件下，用无菌棉签蘸取0.5mL菌悬液均匀涂布于平板上，再用无菌镊子夹取浸有供试液的滤纸3片，间隔一定距离贴在含菌平板上，然后将各平皿分别置于恒温培养箱中进行培养(37℃、24h)，测定抑菌圈直径，重复3次取平均值。1.3薤白抗菌物质提取条件优化[15-17]

根据单因素试验结果，运用响应面法对薤白抗菌物质的提取条件进行优化，以浸提的液料比、时间、浸提次数、提取温度为自变量，采用Minitab 15软件，以抑菌圈直径为响应值，设计四因素中心复合响应面分析试验，共31组试验，并对分析结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 加水量的确定由表1可知，随着加水量的增加，薤白抗菌物质的抑菌圈直径有所增加，即抗菌能力增强。这主要是由于随着水的增多，水与薤白浆液充分接触，而将其中的抗菌物质不断从细胞中溶出，当加水量大于2倍时，达到较好的抑菌效果，此后，虽然加水量持续增加而抑菌圈直径增加不明显，趋于平缓。同时，薤白抗菌物质对于金黄色葡萄球菌的抵抗能力要大于其对大肠杆菌的抑制能力。综上所述，可将加水量确定为薤白匀浆体积的2倍量。

表1 不同加水量对薤白抗菌能力的影响Table 1 Effect of water amount on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

2.1.2 提取时间的确定

表2 不同浸提时间对薤白抗菌能力的影响Table 2 Effect of extraction time on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

由表2可知，随着提取时间的延长，薤白水提液的抑菌圈直径增加，而抑菌圈在3.0h之后趋于平缓，这是由于薤白中抗菌物质在水中溶解度较好，一定时间内即可以浸提出大部分的抗菌物质，如果再延长浸提时间，其抑菌效果趋于一定值，不会有明显变化。因此可将提取时间确定为3h。

2.1.3 提取次数的确定

表3 不同提取次数对薤白抗菌能力的影响Table 3 Effect of extraction number on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

由表3可知，薤白水提液的抑菌能力随着提取次数的增加而有所增加，3次提取与4次提取的抑菌效果已无明显差异，主要是由于本试验是在加水量及提取时间确定后完成的，薤白中的抗菌物质基本上已经完全溶入溶液中，因此提取3次之后无明显的变化，由此可将提取次数确定为3次。

2.1.4 提取温度的确定

表4 不同提取温度对薤白抗菌能力的影响Table 4 Effect of extraction temperature on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

由表4可知，薤白水提液的抑菌能力随着提取温度的升高而有所增加，主要是由于升高温度有助于有效抗菌物质的溶出，但是温度过高，影响抗菌效果，由此可将提取温度确定为25℃。

2.2 响应面分析

2.2.1 因素水平设计

根据单因素试验结果，设计响应面分析，经过比较，薤白水提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，因此采用其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径作为指标，设计因素水平编码见表5。

表5 薤白抗菌物质提取响应面试验因素水平编码表Table 5 Coded values and corresponding actual values of variables in response surface analysis

2.2.2 响应面试验结果与分析

利用Minitab 15软件对试验数据进行响应面设计，试验方案及结果见表6。

表6 薤白抗菌物质提取响应面试验设计及结果Table 6 Experimental scheme for response surface analysis and corresponding experimental data

表7 回归模型系数的显著性检验Table 7 Significance test of each regression coefficient of the established regression equation with anti-Staphyloccocus aureus circle diameter as a function

利用Minitab 15软件对试验数据进行因素分析，显著检验结果如表7所示。

由表8可知，总回归系数R2为0.9524，决定系数R2Adj为0.9268。从分析中可以得出，回归模型P＜0.05，说明模型显著，得到二元多次回归模型：

由显著性分析可知，模型显著，失拟项P＞0.05，不显著；相关系数R2=0.9524，说明拟合程度良好，试验误差小，因此可以用此模型来分析和预测薤白抗菌物质的水浸提工艺条件。

经Minitab 15软件分析得2因素响应面及其等高线图，其中提取时间(X2)、提取温度(X4)及其交互作用显著，如图1所示，在试验范围内，抑菌圈直径存在最大值。对所得回归方程求导，得到抑菌效果最佳时的薤白抗菌物质水浸提条件：加水量为薤白浆液的1.98倍，在31.5℃提取3.5次，每次3.3h，此条件下，薤白水提液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到14.25mm。

表8 回归模型的方差分析Table 8 Variance analysis of the established regression equation with anti-Staphyloccocus aureus circle diameter as a function

图1 抑菌圈直径与提取温度、提取时间的等高线和响应面图Fig.1 Response surface and contour plot showing the effects of extraction temperature and time on anti-Staphyloccocus aureus circle diameter

2.2.3 回归模型验证实验

经过试验设计和结果分析得到的优化薤白水浸提条件：加水量为薤白浆液的2倍，在32℃提取4次，每次3h，在此条件下，得到的金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为13.98mm，与模型预测值14.25mm之间的误差小于5%。薤白水浸提工艺条件经过响应面分析方法的优化，得到最佳条件。

3 结 论

通过单因素试验以及响应面分析方法，对薤白中抗菌物质的水浸提工艺流程进行优化，最终确定水浸提工艺为加水量为薤白浆液的2倍，在32℃提取4次，每次3h，所得到的抗菌物质的抗菌性较好，进行金黄色葡萄球菌的抑菌试验，得到抑菌圈直径达到13.98mm。抑菌效果明显，为天然食品防腐剂的开发和利用提供了参考。

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Process Optimization for Aqueous Extraction of Anti-Staphyloccocus aureus Substances from Allium macrostemon Bunge

ZHANG Chuan-jun，LIU Chao，JIANG Xiao-kun
(School of Food Technology, Jilin Agricultural Science and Technology College, Jilin 132101, China)

Previous studies have showed that Allium macrostemon Bunge is a broad-spectrum antimicrobial plant. In the present study, crude aqueous extracts isolated from Allium macrostemon Bunge under different levels of water amount as well as extraction time, temperature and number were tested comparatively for their anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities, and the plant showed better inhibitory effect against Staphyloccocus aureus than against anti-Escherichia coli. To obtain highly active anti-Staphyloccocus aureus substances from Allium macrostemon Bunge, the above four extraction conditions were optimized by response surface methodology based on inhibition circle diameter against Staphyloccocus aureus. The optimum levels of water amount as well as extraction time, temperature and number were determined to be 2-fold volume, 3 h (each time), 32 ℃ and 4, respectively, and under these conditions an extract with an inhibition circle diameter of 13.98 mm was obtained. Therefore, Allium macrostemon Bunge has the potential to be developed into a natural food preservative.

Allium macrostemon Bunge；antibacterial substance；extraction

TQ455.5

A

1002-6630(2011)04-0078-04

2010-09-13

张传军(1958—)，男，副教授，硕士，研究方向为农副产品深加工。E-mail：zhangchuanjun502@126.com