湖北部分地区鸭疫里氏杆菌的分离鉴定*

艾地云,姚 琪,罗 玲,邵华斌,杨 峻,杨前平,王红琳,温国元,罗青平,张蓉蓉

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,湖北武汉 430064;

2.武汉理工大学资源与环境工程学院,湖北武汉 430070)

湖北部分地区鸭疫里氏杆菌的分离鉴定*

艾地云1,姚 琪2,罗 玲1,邵华斌1,杨 峻1,杨前平1,王红琳1,温国元1,罗青平1,张蓉蓉1

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,湖北武汉 430064;

2.武汉理工大学资源与环境工程学院,湖北武汉 430070)

对湖北省部分地区鸭疫里氏杆菌(RA)进行分离鉴定。应用胰蛋白大豆琼脂(TSA)培养基的分离培养及染色试验、生化试验、PCR鉴定,得到86株RA。染色观察各地RA分离株的细菌形态一致,符合RA特征;生化试验显示86株RA的生理生化特征相似,基本符合RA特征;应用建立的PCR技术均可从这些菌株扩增到RA的特异性基因片段。通过与阳性血清所做的玻片凝集试验,证明分离出的RA菌株全部属于血清1型。8个地区(市)的20个养鸭场皆分离出RA。经统计,脑组织中RA分出率(81/86)明显高于心血(53/86)及肝组织(49/86);10日龄～21日龄鸭最易感,且鸭感染RA呈明显的年龄抵抗性;樱桃谷鸭最易感。在RA阳性病料中同时分离到28株大肠埃希菌,显示其与鸭大肠埃希菌混合感染率高达32.56%。人工感染鸭的致病性试验结果显示,RA的致病力较强,与大肠埃希菌混合感染的致病力更强。结果表明鸭疫里氏杆菌病已成为湖北省养鸭业最常见的、危害最大的细菌性传染病之一。

鸭疫里氏杆菌;分离与鉴定;血清型;混合感染;致病性试验

鸭疫里氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎,是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipesti f er,RA)引起的鸭的一种细菌性传染病,主要侵害2周龄～8周龄鸭,以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎为主要的病理特征,发病率 5%～90%,病死率可高达90%[1-7]。Riemer于1904年最早报道了鹅感染RA发病,郭玉璞等于1982年首次报道我国在北京发现鸭感染RA发病,此后在全国各地相继有该病发生的报道[2-7],已报道的RA有21个血清型,各地流行的 RA血清型各不相同,以1、2型RA最为多见,而各血清型之间缺乏交叉免疫保护,给应用疫苗接种防控该病增加了难度。近年来湖北省规模化养鸭业发展迅猛,鸭传染性浆膜炎的病死率高达10%～30%,给当地养鸭业造成了较大的经济损失。为了摸清该病在湖北省的危害情况和发生规律,确定当地RA流行株的血清型等,开展了本调查研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2008年3月～2009年3月间,在湖北省武汉、黄冈、黄石、荆门、荆州、咸宁、仙桃、天门、潜江9个主要养鸭地区(市)21个规模化鸭场,收集的具有典型传染性浆膜炎病变的死鸭或同群病鸭196羽,其品种有樱桃谷肉鸭、樱桃谷种鸭、汉南1号蛋鸭、地方麻鸭肉鸭、地方麻鸭蛋鸭,日龄范围为10日龄～42日龄。

1.1.2 培养基 Tryptic Soy Agar(TSA)为Difco公司产品;麦康凯琼脂、小牛血清(FCS)为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。TSA琼脂(含50 g/L FCS)、麦康凯琼脂培养基按各自使用说明书自行制备。

1.1.3 细菌微量生化反应管 杭州微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 分型血清 1、2、5、7、9型 RA 标准阳性血清由中国农业大学动物医学院苏敬良教授及扬州大学兽医学院朱国祥教授惠赠。

1.1.5 核酸提取试剂盒和PCR引物 试剂盒为上海华舜生物技术有限公司产品;PCR引物序列参照文 献 [8],上 游 引 物 5′-CAGCT TAACTGTAGAACTGC-3′,下游引物 5′-TCGAGAT TTGCATCACT TCG-3′,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.6 试验用动物 1日龄健康樱桃谷鸭为武汉市黄陂某种鸭场孵化,饲养14 d,期间不进行疫苗免疫,无任何发病症状。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定

1.2.1.1 细菌的分离培养 无菌采集病、死鸭的脑、心血、肝并划线接种到TSA(含 50 g/L FCS)培养基和麦康凯培养基,将 TSA培养基置于烛缸内,然后与麦康凯培养基一起置37℃培养24 h,观察细菌的生长情况。

挑取在 TSA培养基上呈圆形凸起、边缘整齐、半透明、有光泽、成奶油状,直径为 0.5 mm～1.5 mm、用折射光观察可见微弱虹光的单个菌落,同时划线接种于TSA(含50 g/L FCS)及麦康凯培养基,同上37℃培养24 h。在麦康凯培养基上不生长的菌落为可疑 RA,在TSA(含50 g/L FCS)培养基上纯化培养此菌,待进一步鉴定。

在麦康凯培养基上生长的红色菌落为可疑大肠埃希菌(Escherichia coli),大肠埃希菌的纯化、鉴定及O型血清型鉴定参考文献[9]。

1.2.1.2 细菌形态观察 挑取少许分离菌纯培养物涂片、进行革兰染色及瑞特染色,镜检。

1.2.1.3 细菌生化试验 选择氧化酶、酶触、明胶、H2S、山梨醇、卫矛醇、肌醇、木糖、棉子糖、阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、尿素酶、枸橼酸盐、硝酸盐还原微量生化反应管进行试验。用无菌生理盐水将分离菌纯培养物洗下并制成悬液,分别接种于各微量生化反应管,37℃放置(除明胶置20℃室温之外)48 h,观察结果。

1.2.1.4 RA PCR鉴定 参照文献[8,10-12]的方法,以分离菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,引物扩增的目的条带大小为662 bp。反应体系(50 μL):10 ×reaction buffer 5 μL,上下游引物 各20 pmol,dNTP各10 nmol,Taq酶2.5 U,模板1 μL,加水补足至 50 μL。扩增反应程序:94℃5min;94℃50 s,55℃50 s,72℃1 min,30个循环;72℃7 min。对扩增的16 S rRNA基因片段纯化产物进行测序分析,PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.1.5 RA血清型鉴定 采用玻片凝集法进行。于无菌载玻片上滴无菌生理盐水1滴,用接种环沾取待检菌纯培养物少许,与生理盐水混匀,滴加未稀释的阳性血清1滴,混匀,室温静置,3min内判定结果,以大肠埃希菌、生理盐水作阴性对照。3min内,出现清晰的乳白色颗粒状凝集为阳性,不出现者为阴性。

1.2.2 动物回归试验 选择具有代表性的分离株(20株RA、15株E.coli,即每个鸭场各选1株)纯培养物,用灭菌生理盐水将所有分离菌的菌落洗下,用平均计数法调整活菌浓度,制成RA悬液(含RA约1×109cfu/mL)、E.coli悬液(含E.coli约5×1010cfu/mL)和 RA+E.coli混合悬液(含RA 约 1×109cfu/mL、E.coli约5×1010cfu/mL)。将32只14日龄健康樱桃谷鸭分为4个组,其中3个试验组、1个对照组,8只/组。试验1组每只腹腔注射0.5 mLRA悬液,试验2组每只腹腔注射0.5 mLE.coli悬液,试验3组每只腹腔注射0.5 mL RA+E.coli混合悬液,对照组每只腹腔注射0.5 mL灭菌生理盐水。分开饲养,饲养条件相同,观察14 d,对所有试验鸭进行剖检并分离鉴定病原菌。

2 结果

2.1 病原菌的分离结果

从196羽具有传染性浆膜炎病变的病、死鸭的脑、心血和肝中共分离出86株RA,其中武汉、荆州、黄冈、黄石、荆门、咸宁、仙桃、天门、潜江分别分离出21 、9、5、0、8、10、7、8、18 株,分出率为43.88%。其中从脑组织中分离出81株,分出率为94.19%;从心血中分离出53株,分出率为61.63%;从肝脏组织中分离出49株,分出率为56.98%。从RA阳性病料中分离出28株大肠埃希菌,鸭RA与E.coli的混合感染率为32.56%。湖北省9个地市21个养鸭场有8个地市20个养鸭场分离出RA。从10日龄～42日龄病、死鸭中皆分离出RA,其中10日龄～21日龄分离数量最多,占总数的87.21%;从各品种病、死鸭中皆分离出 RA,其中樱桃谷肉鸭分离数量最多(表1～表2)。

表1 各日龄病、死鸭RA分离情况Table 1 The results of the RA strains isolated from ducks in different day s of age

2.2 RA的鉴定结果

2.2.1 RA的形态鉴定结果 86株RA分离株均呈革兰阴性、不运动、无芽胞、单个或成双存在、偶见有长丝状的短小杆菌,瑞特染色呈两极浓染,符合RA的形态特征。

2.2.2 RA的生化鉴定结果 86株RA分离株的生化鉴定结果见表3。结果显示氧化酶、触酶、明胶皆为阳性反应;葡萄糖(5/86)、蔗糖(5/86)、硝酸盐还原(4/86)约5%为阳性反应,约95%为阴性反应;木糖、肌醇、卫茅醇、硫化氢、柠檬酸盐皆为阴性反应,基本符合RA的生化特性。

2.2.3 RA的PCR鉴定结果 86株 RA分离株的16 S rRNA基因片段PCR扩增结果均为阳性,部分RA分离株的PCR扩增结果见图1。PCR扩增的基因片段大小约为662 bp,基因片段测序结果经NCBI blast比对,分离菌株的基因片段序列与鸭疫里氏杆菌的16 S rRNA基因同源性达98%以上。

2.2.4 RA的血清学鉴定结果 所有RA分离株与RA1型阳性血清的玻片凝集反应均呈阳性,与其他型标准血清的玻片凝集反应均呈阴性,表明86株RA均属血清1型。

2.3 动物回归试验结果

试验鸭在人工感染分离菌后12 h,试验组鸭开始出现精神沉郁,行动迟缓,排绿色稀粪,共济失调。人工感染RA+E.coli后24 h,试验3组鸭全部死亡,死亡率为100%;人工感染RA后36 h试验1组鸭死亡7只、发病 1只,死亡率为87.50%,病死率为100%;人工感染E.coli后36 h试验2组鸭死亡4只、发病3只,死亡率为50.00%,病死率为87.50%;至第14天,试验组再无鸭死亡,对照组鸭无任何症状、无死亡。剖检可见试验组死鸭心包积液浑浊,心包膜增厚、气囊壁增厚、肝肿大、脑肿大,呈急性鸭疫里氏杆菌病及大肠杆菌病病理特征;试验组发病鸭有典型的纤维素性＂三炎＂特征;对照组鸭正常。无菌取试验鸭脑组织进行病原菌的分离培养及鉴定,结果从试验1组鸭脑中分离到RA,从试验2组鸭脑中分离到E.coli,从试验3组鸭脑中分离到RA及E.coli,而对照组鸭脑中没有分离出RA和E.coli,说明试验组鸭发病、死亡皆由人工感染所致。

表2 各品种病、死鸭RA分离情况Table 2 The results of the RA strains isolated from ducks in different variety duck

表3 86株RA分离株的生化试验结果Table 3 The results of biochemical tests of 86 RA strains

图1 21株鸭疫里氏杆菌的PCR扩增结果Fig.1 The PCR results of 21 RA strains

3 讨论

从收集的196羽具有传染性浆膜炎病变的病、死鸭中分离到86株RA,分离率为43.88%。调查了湖北省9个地市21个鸭场,其中有8个地市20个养鸭场均分离出RA。说明鸭疫里氏杆菌病已成为该省引起鸭发病、死亡最主要的细菌性疾病,其中有1个市未分离到RA,可能是新鸭场的缘故。在RA阳性病料中同时分离到28株大肠埃希菌。说明该地区鸭疫里氏杆菌病以RA单一感染为主(感染率为67.44%)、与鸭E.coli混合感染情况(感染率为32.56%)较为严重,据杨宗维等[7]报道南宁市RA与E.coli混合感染率为31.08%,言天久等[5]报道百色市 RA与E.coli混合感染率高达56.45%,说明我国各地鸭场 RA与E.coli混合感染普遍存在,所以在进行鸭疫里氏杆菌病的防控时,应同时考虑鸭大肠杆菌病,才能取得好的预期效果。

血清型鉴定86株RA全部属于血清1型,说明目前湖北省流行的RA以血清1型为主。鸭疫里氏杆菌有21个血清型,据报道我国流行的主要有1、2、3、6、7、10、11、13、14 等,1、2 最为广泛流行 ,且各个血清型间的交叉保护性不强[12-15],提示湖北省应该用1型鸭疫里氏杆菌病疫苗接种预防该病。

研究结果表明RA对鸭的感染日龄主要分布在10日龄～42日龄。由于1周龄鸭体内母源抗体可提供足够的保护力,几乎不发生该病。10日龄～21日龄鸭感染率最高(占87.21%)。在10日龄～42日龄范围内,鸭对RA感染呈明显年龄抵抗力。结果还显示樱桃谷鸭对RA最易感、其次为地方麻鸭、汉南1号蛋鸭。与言天久等[5]报道2周龄～5周龄雏鸭最易感,北京鸭相比樱桃谷鸭、靖西大麻鸭、西林麻鸭、番鸭最易感;杨宗维等[7]报道2周龄～6周龄肉鸭对RA的感染表现出明显的年龄抵抗力结果相似。

从不同地区分离出的86株RA的菌落形态、细菌形态一致,其生理生化特征基本一致,但约有5%的菌株对葡萄糖(5/86)、蔗糖(5/86)、硝酸盐还原(4/86)反应为阳性是例外。据冯金牛等[11]报道RA分离株氧化酶阳性率约83.30%,明胶阳性率为50%;杨宗维等[7]报道RA分离株果糖发酵阳性率约5.41%,氧化酶阳性率约81.08%,明胶液化阳性率约41.89%;李婧等[14]报道 RA分离株对各种糖、氨基酸、明胶的生化试验结果不尽相同。但RA硝酸盐还原反应为阳性反应尚未见报道,原因有待查明。

分离菌株人工感染14日龄雏鸭时,RA单独感染时毒力很强,鸭病死率为100%;RA与E.coli混合感染时毒力更强,死亡率为 100%。与言天久等[5]报道RA单独感染的发病率87.5%、死亡率71.4%,RA与E.coli混合感染发病率100%、死亡率75%的结果较为一致。表明该研究RA分离株为有较强毒力的菌株,可用作制备疫苗的备选菌株。

[1]Saif Y M.禽病学[M].11版.苏敬良,高 福,索 勋,译.北京:中国农业出版社,2005:767-772.

[2]刘传华,赵艳丽,王玉海,等.鸭疫里默氏菌研究进展[J].动物医学进展,2008,29(5):91-93.

[3]黄承洪,李继祥,黄 伟,等.重庆和四川地区鸭疫里默氏杆菌流行动态研究[J].中国预防兽医学报,2007,29(1):67-70.

[4]吴彩艳,覃宗华,袁建丰,等.广东地区鸭疫里氏杆菌的血清型及抗药性情况调查[J].畜牧与兽医,2009,41(5):22-25.

[5]言天久,韦 平,潘 懿,等.百色市鸭疫里默氏杆菌病的流行病学及其病原的分离与鉴定[J].广西农业生物科学,2007,26(4):298-308.

[6]谢永平,陈泽祥,许力干,等.鸭疫里氏杆菌油乳剂三价灭活疫苗的研究[J].动物医学进展,2010,31(7):45-48.

[7]杨宗维,韦 平,周 祥,等.南宁市商业肉鸭鸭疫里默氏杆菌病的调查研究[J].广西农业生物科学,2006,25(3):210-213.

[8]Tsai H J,Liu Y T,Tseng C S,et al.Genetic variation of the ompA and 16S rRN A genes ofRiemerella anatipesti fer[J].Avian Pathol,2005,34(1):55-64.

[9]罗 玲,艾地云,杨 峻,等.湖北省部分地区鸭致病性大肠杆菌的分离与血清型鉴定[J].中国家禽,2009,31(8):44-45.

[10]Christensen H,Bisgaard M.Phylogenetic relationships ofRiemerella anatipestif erserovars and related taxa and an evaluation of specific PCR tests reported forR.anatipesti fer[J].J Appl Microbiol,2010,108(5):1612-1619.

[11]冯金牛,阮二垒,杨丽云,等.鸭疫里氏杆菌的分离与 16 S rRNA的鉴定[J].动物医学进展,2010,31(6):73-76.

[12]林树乾,张 燕,于可响,等.鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立与应用[J].山东农业科学,2009(8):107-110.

[13]张大丙,曲丰发,郑献进.鸭疫里默氏菌血清型的研究概况[J].中国兽医杂志,2006,42(11):38-40.

[14]李 婧,朱瑞良,李 舫,等.山东地区3型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及主要生物学特性研究[J].中国动物传染病学报,2009,17(3):49-54.

[15]孙英峰,李秀丽.鸭疫里默氏杆菌生物学特性研究进展[J].中国畜牧兽医,2008,35(12):130-132.

Isolation and Identification ofRiemerella anatipesti ferin Some Areas of Hubei Province

AI Di-yun1,YAO Qi2,LUO Ling1,SHAO Hua-bin1,YANG Jun1,YANG Qian-ping1,WANG Hong-lin1,WEN Guo-yuan1,LUO Qing-ping1,ZHANG Rong-rong1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding,Wuhan,Hubei,430064,China;2.School of Natural Resources and Environmental Engineering,Wuhan University of Technology,Wuhan,Hubei,430070,China)

Riemerella anatipesti fer(RA)was identified from duck farms in Hubei.The bacteria were identified as RA by the Gram stain test,biochemical reaction and PCR amplifications of the outer membrane gene.Each RA strain originated from different districts had identical morphology,approximate biochemical characteristics and Specific gene fragment of RA was amplified.Slide agglutination test demonstrated that all the RA isolates belong to serotype 1.The RA isolates was isolated on 20 duck farms with different variety ducks in 8 counties of Hubei.The isolation rate of brain(81/86)was significant higher than that of heart blood(53/86)and liver(49/86).Ducklings of 10 day-old to 21 day-old and Cherry valley ducks were more susceptive than that of others to RA infection.A significant age resistance against RA infection was observed during the period of 10 day-old to 42 day-old.28Escherichia coliwere isolated concurrently from the RA positive ducks,and with a 32.56%co-infection rate.Challenge test showed that RA is virulent and even more virulent when co-infected withE.coli.The results showed that RA infection was one of the most common causes for the losses in duck industry.

Riemerella anatipesti fer;isolation and identification;serotype;co-infection;pathogenicity test

S858.32

A

1007-5038(2011)09-0046-05

2011-03-29

湖北省科技攻关计划项目(2007AA201E02);湖北省科技计划研究与开发计划项目(2009BBB003)

艾地云(1962-),女,湖北随县人,副研究员,硕士,主要从事家禽传染病综合防控研究