EgM9免疫犬引起细胞因子表达的变化规律研究

郭宝平,石保新,张壮志,吐尔洪◦依米提,古努尔◦吐尔逊,哈斯也提◦艾力,王进成,刘 斌,张文宝*,丁晓玲,阿不都

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830000;2.新疆疾病预防控制中心,新疆乌鲁木齐 830011;3.新疆实验动物研究中心,新疆乌鲁木齐 830002;4.乌鲁木齐市动物卫生监督所,乌鲁木齐 830000)

EgM9免疫犬引起细胞因子表达的变化规律研究

郭宝平1,2,石保新1,张壮志1,吐尔洪◦依米提1,古努尔◦吐尔逊1,哈斯也提◦艾力1,王进成1,刘 斌3,张文宝1*,丁晓玲4,阿不都4

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830000;2.新疆疾病预防控制中心,新疆乌鲁木齐 830011;3.新疆实验动物研究中心,新疆乌鲁木齐 830002;4.乌鲁木齐市动物卫生监督所,乌鲁木齐 830000)

用重组表达蛋白EgM9免疫犬,通过实时定量PCR方法检测IFN-γ和IL-4表达的变化规律。用 Trizol试剂提取新鲜全血的总 RNA,取0.5 μg总RNA,采用实时定量PCR法逆转录扩增 IFN-γ、IL-4和内参基因G3PDH,扩增产物经电泳分离后,用凝胶图像分析仪照相和扫描分析,检测其相对表达量。IFN-γ、IL-4和G3PDH分别在202、316、282 bp处出现明显条带,与GenBank查阅的基因条带大小基本一致;0、6、10、15周表达量依次升高,在15周时最高,IFN-γ尤为明显,它的变化始终大于 IL-4。EgM9免疫犬后,能激起犬体内很强的细胞免疫和体液免疫反应,而且细胞免疫处主导地位。实时定量PCR方法为犬感染细粒棘球绦虫及其他疾病的早期诊断和流行病学调查提供了初步依据。

EgM9;免疫机理;细胞免疫;体液免疫;犬

*通讯作者

近年来对T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)的研究取得令人瞩目的进展,Th1和Th2能反映动物体内免疫的变化规律[1-3]。真核生物的寄生虫非常复杂,免疫系统很难将其从宿主体内清除出去,因此针对许多寄生虫的免疫反应可能非常强而且是持续的,并常常是固定在某一特定的调节状态在寄生虫感染的免疫应答过程中,辅助性T细胞(Th细胞)处于核心位置,决定免疫特异性及发生何种免疫应答。体液免疫与细胞免疫的交互调节主要在于Th亚群间的调节,Th1细胞通过分泌IL-2 IFN-γ和TNF-β促进细胞免疫。Th2细胞通过分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及 IL-13 促 进体 液免疫[4]。本试验用重组表达蛋白EgM9免疫犬,通过实时实时定量PCR方法检测IFN-γ和IL-4表达的变化规律,探索EgM9免疫犬后引起的免疫机理。本实验应用定量逆转录聚合酶链反应,检测免疫犬及攻击原头节后细胞因子IFN-γ及IL-4的mRNA的表达水平,并且利用 3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)引物作为标准参照基因,获得了比较好的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用犬 利用自繁的犬,饲养在隔离室中,8只犬/组,共16只。在试验前,检测了每只犬的生理状况,并注射了犬用五联疫苗后观察,用吡喹酮(5 mg/kg)驱虫,利用McMaster slid的方法收集3 g粪便,检查是否带有细粒棘球绦虫虫卵。

1.1.2 主要试剂和仪器 T rizol为BBI公司产品,反转录试剂盒、IReal Time PCR试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品,Agarose为SeaKem公司产品,MOPS为 Sigma公司产品,DNA Ladder Marker为 T rans Biotech公司产品;Real-Time PCR仪为Bio-Rad公司的iQ5型号,RNA定量仪为Eppendroff公司产品,凝胶成像仪为Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 编组及免疫剂量 设一个EgM9免疫组及一个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白对照组,8只犬/组,免疫组犬号为1376、1377、1380、1388、1389,对照组犬号为 1378,1381,1383,1384,1390,1391(由于QuilA毒性比较大,其剩余的几只犬在免疫试验初期死亡)分颈部皮下和后腿肌肉两点注射,EgM9组的犬注射等体积的EgM9和佐剂QuilA的混合物,GST组犬注射等体积的GST和佐剂QuilA的混合物,每只犬免疫接种100 μg蛋白及5 mg QuilA,两组的注射量和注射部位相同。

1.2.2 佐剂及免疫程序 佐剂为QuilA(batch№L77-129b Superfos biosector Denmark),共免疫 3次,一免和二免间隔期 3周,二免和三免间隔期2周。在三次免疫后的2周后(第7周),经口感染原头节(protoscoleces PSCs)200 000枚,感染 45 d后剖检犬,并统计荷虫量。

1.2.3 血清的处理 自试验开始0周起每2周定期采血,4 000 r/min离心15 min,离心后收集血清,-20℃待用

1.2.4 引物的设计与合成 根据在基因库(EMBL/GenBank)中细胞因子的序列,设计了犬的细胞因子的扩增引物,如下:IFN-γ(S41201,202bp):上游引物5′-CAT TCAAAGGAGCATGGATACC-3′,下 游引 物 5′-GACTCCTT TTCCGCITCCTI′AG-3′;IL-4(AF054833,316 bp):上游引物 5′-CCTCCCAACTGATTCCAACTC-3′,下游引物上游引物5′-GATT TCAT TCATAGAACAGGTC-3′,3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH,AF054608,282 bp)引物作为标准参照基因,其上游引物5′-GTGATGCTGGTGCTGAGTATG-3′,下游 引物 5′-GTGATGGCATGGACTGTGG-3′。

1.2.5 总 RNA的提取 采集的新鲜血液加入到含有柠檬酸钠的抗凝管中,离心提取中间的白细胞,并用PBS和双蒸水洗涤,5 000 r/min离心5 min,液氮中保存。从液氮中取出装有白细胞的1.5 mL离心管,加入1 mL的 Trizol提取总RNA,其他步骤参照说明书操作。测定的样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的含量和纯度。

1.2.6 甲醛变性琼脂糖电泳 处理好的电泳槽内加入大约300 mL的1×FA Gel buffer;提取好的RNA中加入 1×FA Running buffer,65℃温育3 min～5 min,冰上冷却,加入1/5体积 5×RNA Loading buffer,再上样平衡好FA Gel;电泳条件:在1×FA Running buffer中以5 V/cm2～7 V/cm2恒压电泳,每0.5 min用tip头吸取两极的电极液,使之混匀,以避免电泳过程中产生的碱性梯度降解RNA。一般在冰上电泳,小胶板50 V～60 V,约1 h;电泳后,在凝胶成像仪中观察并拍照。

1.2.7 RT-PCR反应条件 42℃反转录反应15 min;95℃反应2 min使反转录酶失活。2 μL 5 ×ExScriptTMRTase buffer,0.5 μL dNTP Mixture(各 10 mmol/L),0.5 μL Oligo dT Primer(50 mmol/L),0.25 μL ExScriptTMRTase(200 U/μL),0.25 μL RTase Inhibitor(40 U/μL),XμL Total RNA(模板为 200 ng),加 RTase Free H2O至 10 μL,反应体系共 10 μL 。

1.2.8 Real-time PCR反应条件 95℃10 s;95℃预变性5 s,60℃中退火延伸34 s,共40个循环。具体加样如下:10μL SYBR Premix ExTaqTM(2 ×),2 μL(20 μ mol/L)PCR Forward Primer,2 μL(20 μ mol/L)PCR Reverse Primer,2 μL 模板,0.4 μL Rox,加ddH2O(灭菌蒸馏水)至20 μL,反应体系共 20 μL 。

1.2.9 PCR扩增产物的电泳 处理好的电泳槽内加入大约300 mL的1×DNA Gel buffer;取扩增好的PCR反应液5 μL,加入1/5体积5×DNA Loading buffer混合后上样;电泳条件为1×DNA Running buffer中以5 V/cm2～7 V/cm2恒压电泳,小胶板50 V～60 V,约35 min;电泳后,在凝胶成像仪中成像并拍照。

2 结果

2.1 RNA提取结果

运用定量方法检测特异基因表达量,应用Tri zol试剂盒提取细胞总RNA,并且做甲醛变性胶电泳分析总RNA是否完整及降解。从图1可以看到提取的0周的RNA完整,纯度高,3条带都比较清楚完整。

2.2 实时定量PCR琼脂糖凝胶结果

2.2.1 IL-4扩增结果 从图2(A为0周、B为15周时的血样)结果中我们可以看到,扩增的IL-4片段比较清楚,IL-4位置在316 bp,和GenBank所查阅的基因相似,扩增的片段是目的片段。

2.2.2 IFN-γ的扩增结果 从图3结果可以看出,扩增的15周血样的IFN-γ片段比较模糊,IFN-γ位置基本在202 bp,和GenBank所查阅的基因相似,扩增的片段是目的片段。

2.2.3 15周血样中IFN-γ、IL-4和内参基因的扩增结果 从图4中可以看出,IL-4和G 3PDH扩增的条带比较明显,其中IL-4与图2扩增的条带大小一致,而IFN-γ则与图3扩增的条带基本相似,但是比较模糊。

图1 RNA的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 The ex tracted RNA by agaragar electrophoresis

图2 IL-4的PCR扩增结果Fig.2 The IL-4 gene amplified by PCR

图3 IFN-γ的PCR扩增结果Fig.3 The IFN-γgene amplified by PCR

图 4 第15周的IFN-γ,IL-4和内参基因PCR扩增结果Fig.4 The IFN-γ,IL-4 and reference gene amplified by PCR in 15th week

2.3 实时定量PCR测定的0周和15周的Ct结果

从表1可以看出,每次的读数值基本一致,差异不显著 ,但是 IFN-γ、IL-4 、G3PDH 相比 较,大小依次为 IL-4、IFN-γ、G3PDH,说明在细胞的表达过程中,IFN-γ的表达量高于IL-4。

2.4 实时定量PCR结果

把0周的IFN-γ和IL-4当成一个单位即 1,可以得出它们在 0、6、10、15周增长的倍数(图 5);也可以把0周IFN-γ和IL-4当成一个单位即1,相应的它们在0、6、10、15周增长的倍数也就是2的n次幂即增长指数(图6)。

表1 Real-time PCR测定0周和15周血样的CtTable 1 The Ctdetermined by real-time PCR in 0 and 15th week samples

图5 增长倍数分析结果Fig.5 The analysis result of increase multiple

图6 增长指数分析结果Fig.6 The analysis result of power multiple

3 讨论

实时定量方法具有灵敏度高、特异性强、可对大量样本同时进行分析的优点。实时定量方法扩增特异性片段时所用的染料是SYBR GreenⅠ,这是最经济的方法,但需要优化PCR反应,使引物不形成聚合体。这是SYBR GreenⅠ染料不能分辨真正模板和人工模带,不像TaqMan探针和分子指标。在PCR反应体系中,加入过量的SYBR GreenⅠ荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入到DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

在应用定量方法检测特异基因表达量的差异时,总RNA的质量至关重要,只有在总RNA 未被降解的情况下,才能保证其中mRNA的完整性,从而真实反映起始模板中基因表达量的差异。本试验采用此方法提取的RNA含量和纯度都比较高,与文献[4]报道相符。同时在进行逆转录之前,总RNA的定量也是试验的关键步骤,在本研究中逆转录时,所有的样本都使用0.5 μg总RNA作为起始模板,从而保证了随后的PCR扩增条带亮度的差异,能够真实反映基因表达的实际情况。作为内参基因的G3PDH基因属保守性强,在细胞内表达恒定,G3PDH的mRNA具有普遍而恒定表达的特性,设立内参照可减少因加样造成的误差或RNA定量时产生的误差。

从扩增的犬IL-4(图2)中可以比较清楚的看到,IL-4扩增的片段清晰,比扩增的 IFN-γ清楚,造成IFN-γ扩增不清晰且有杂带的可能是由于做 PCR前我们设计的引物特异性不高,容易产生杂带;另一个原因可能是做PCR时退火和延伸的温度低,影响DNA的延伸;也可能是在操作的过程中的污染而造成一些杂带的形成,以及琼脂糖没有充分溶解后倒胶。

从结果看,IFN-γ表达水平是0周的1 000倍以上,IL-4也有将近20倍的增加,说明其诱导细胞Th1和Th2显著上升,能诱发很强的细胞免疫和体液免疫,而且能产生很好的免疫保护效果。Th1还可通过分泌IFN-γ诱导抗体产生,本试验的抗体水平上升与之有一定的关联。IFN-γ基因表达过程中mRNA的合成远优先于分泌的蛋白,用实时定量PCR方法检测其mRNA表达水平可以衡量起始表达产物的水平,对临床早期诊断有一定的参考价值[7]。IL-4可单独维持Th2的增殖,IL-4通过其受体的信号转导,对Th2细胞活化、分化、增殖及抗凋亡等各种效应都起了十分重要的作用[5-6]。而Th2通过IL-4、IL-6和IL-10促进B细胞分泌IgE抗体,使得IgE水平上升,IgE与肥大细胞和嗜碱粒细胞的高亲和力的受体结合而使机体处于致敏状态,当局部增加IgE时,可能有利于抑制虫体发育,即机体的特异性免疫防御机制[8]。另外,Th2可介导机体的体液反应,与抗蠕虫感染有关,促进机体抗体水平的上升;本试验中,IL-4有明显的升高,与之相符。

剖检试验犬并统计其荷虫量,免疫组和对照组差异比较显著,相对于对照组,免疫组的驱虫可达到86%以上,取得了很好的保护效果;与之相应的是免疫组和对照组的IFN-γ和 IL-4差异也比较显著。首先,很可能由于IL-4大量上升使 Th2升高,促进了B细胞分泌抗体,如:主要抗体IgG及其亚类在免疫组和对照组之间抗体存在显著的差异;这些抗体作用于虫体,使之不能在肠道内存活,同时促进了犬肠道的排虫,以致免疫组中的荷虫量相对于对照组的荷虫量有显著的降低。另外,Th1还可通过分泌IFN-γ也能诱导抗体产生,进一步促进了抗体的分泌,使免疫组和对照组的抗体水平进一步拉大,导致了荷虫量有明显的差距,最后,EgM9有望成为一种有效的疫苗候选基因用于包虫病的防控。

皂苷(QuilA)是一种表面活性剂,可导致红细胞溶解,但在低剂量时却具有佐剂活性,用于多数兽医病毒、细菌和寄生虫疫苗。QuilA又是ISCOMS佐剂的主要组成部分[9],ISCOMS已广泛用于人及兽用疫苗的佐剂,它能激起机体的 Th1和 Th2反应[10],在免疫中起到非常重要的作用,在本实验中QuilA起到了非常重要的作用,而且QuilA也可单独作为佐剂用于动物的免疫[13]。

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Expression Levels of INF-γand IL-4 in Dogs Vaccinated withEchinococcus granulosusAdult Specific Protein EgM9

GUO Bao-ping1,2,SHI Bao-xin1,ZHANG Zhuang-zhi1,T URGUN Yimit1,GULINUL Turson1,
HASYET Ali1,WANG Jin-cheng1,LIU Bin3,ZHANG Wen-bao1,DING Xing-ling4,Abdul4

(1.Veterinary Research Institute,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinj iang,830000,China;2.Xinjiang Central for Disease Control and Prevention,Urumqi,Xinjiang,830011,China;
3.The Laboratory Animal Central of Xinjiang,Urumqi,830002,China;
4.Urumqi Animal Inspection Institute,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

Our previous studies showed that EgM9 was specifically expressed in the adult stage ofEchinococcus granulosusand induced protection in dogs against the parasite infection in terms of suppression of egg production and segmentation.To understand the mechanisms underlined the protection,we used normal RT-PCR and quantative real-time PCR to measure the expression levels of two cytokines,INF-γand IL-4 in dogs after vaccinated with recombinant EgM9.The result showed that the vaccination induced a predominant cytokine INF-γexpression in dogs from beginning to the end.Whereas,IL-4 was in low level in 10 weeks after vaccination and then elevated.We conclude that EgM9 predominantly induced a Th1-type immune response which is likely associated with dog protection againstE.granulosusinfection.

EgM9;immune mechanism;cellular;humoral immunity;dog

S852.4

A

1007-5038(2011)09-0013-06

2010-02-24

美国NIH(美国国立医学科学院)项目

郭宝平(1979-),男,陕西人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。