四种中药对结肠小袋虫半数致死浓度的测定＊

杨沛沛，王天奇，闫文朝，代 娟

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

结肠小袋虫病（Balantidiosis）是由结肠小袋虫（Balantidium coli）感染引起的人兽共患寄生虫病，呈世界性分布，主要流行于热带和亚热带地区，可引起宿主腹泻，结肠溃疡和穿孔［1－2］。目前已知人及33种动物可感染该虫。猪结肠小袋虫感染非常普遍，感染率高达20%～100%［3－4］。临床上，可用于抗结肠小袋虫的药物主要是硝基咪唑类化合物，由于它们有“三致”作用，我国农业部已明确规定食品动物禁用或限用这类药物［5］。因此，如何控制食品动物如猪的结肠小袋虫病成为一个难题，为此，我们利用体外急性毒性试验方法中的机率单位法［6－7］，测定了常山、五倍子、二花和乌梅4种中药体外抗结肠小袋虫的半数致死浓度，并进行了比较，为开发应用抗结肠小袋虫中药品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫种 采自豫西地区某养猪场自然发病的病猪粪便，直接镜检发现有大量滋养体。

1.1.2 试剂及药品 DMEM 培养基，10.0g装，Lot№1342967，GIBCOTM；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司生产，生产批号为100424；碳酸氢钠，西安化学试剂厂生产，批号为100623，分析纯；可溶性淀粉，北京海淀区微生物培养基厂生产，批号100517，用前取适量装入洁净小瓶中高压灭菌；常山、五倍子、乌梅、二花购自北京同仁堂（洛阳）有限公司；20g／L甲硝唑注射液，河南华利药业有限责任公司生产，批号为国药准字H41020499。

1.2 方法

1.2.1 DMEM培养液配制 用高压灭菌双蒸馏水溶解DMEM培养基，每1 000mL加碳酸氢钠3.7 g。培养基用G6滤器过滤除菌，4℃保存备用。使用前根据需要用盐酸或氢氧化钠溶液调pH为7.0。

1.2.2 结肠小袋虫培养 取经严格清洗和灭菌的小安瓿，每个小安瓿内加DMEM培养液2.55mL、灭能小牛血清0.45mL、消毒淀粉40mg、青霉素、链霉素1万单位／mL。取粪便样品少许接种于培养液内，在28℃条件下培养48h，镜检后发现大量活动滋养体后用于试验研究，不用于试验时传代转接［8］。

1.2.3 中草药水提取物的制备 将备用的中药各加10倍体积的水浸泡3h，之后用砂锅文火煎煮2 h，将煎液用筛网滤出，余渣再加10倍体积水，文火煎煮2h，合并两次煎液，再用文火浓缩到每mL相当生药0.5g。最后将煎好的药液盛入瓶中加盖高压灭菌，冷却后放入2℃～8℃条件下备用［9－10］。

1.2.4 中药抗结肠小袋虫半数致死浓度的测定用DMEM培养液将中药煎液稀释成所需终浓度梯度的两倍，取24个灭菌小安瓿，每安瓿加培养48h的虫体悬液1mL，之后将其分为8组，每组3个平行。最后每个小安瓿内加入相应浓度的中药煎液1mL。8组小安瓿内中除对照外，其余7个为不同浓度中药煎液。上述小安瓿加盖后放入28℃的恒温培养箱中，2、6、12h后取出观察。观察时，将每个小安瓿内液体充分混匀，吸取40μL滴于载玻片上，加盖玻片，于100×镜暗视野下计数30个视野活虫数。试验时以甲硝唑为质控药物，以同样方法检测其不同时间的半数致死浓度。因没有现有可参考的文献资料，试验所使用的药物浓度梯度是在多次预试验的基础上确定的［11］。

1.2.5 数据计算 采用机率单位法计算LC50及其95%置信限［11］。以对照组（药物浓度为0）3个平行样品试验结束时所查获的平均活虫数（30个视野）为X，以相应试验系列各浓度组3个平行样品，试验结束时所查获的平均活虫数（30个视野）为Y，将（X－Y）／X的值换算为百分数，就是该浓度条件下的虫体死亡率。根据死亡百分率－机率单位换算表，将不同浓度下死亡百分率换算成死亡机率单位。在Excel图表系统下，以横轴表示浓度对数，以纵轴表示机率单位，作XY散点图。顺着所获得的散点作一趋势线（直线），并自动获得该直线的回归方程及决定系数R2。经X2检验回归线符合要求后，可利用该方程求出死亡机率单位5（50%死亡率）时的药物浓度对数，查反对数表就可获得LC50。同时，利用回归方程的斜率求出lgLC50的标准误Sm，则lgLC50的95%置信限＝lgLC50±1.96Sm，最后查反对数表就可获得LC50的95%置信限。

2 结果

2.1 结肠小袋虫的死亡过程

在新鲜粪便样品或培养液中的结肠小袋虫滋养体可借助体表纤毛的摆动作快速旋转式前进或原地转动。前行中的虫体遇到障碍物可迅速掉头；遇到适当的缝隙，可改变体形通过［8］。滋养体在一定浓度的药物作用下，运动能力逐渐减弱，或原地缓慢旋转，或仅胞口处的纤毛小幅度摆动。死亡的滋养体不能运动，体表斜纵列纤毛变直，与体表接近垂直，表膜随后破裂或消失，内容物脱出（图1）。

图1 结肠小袋虫滋养体死亡状态（400×）Fig.1 Death state of trophozoite of Balantidium coli（bar＝50mm）

2.2 半数致死浓度的测定结果

表1～表5分别显示4种中药及甲硝唑不同时间对结肠小袋虫的毒性效应的统计学数据。回归方程经X2检验后，X20.05＞X2，说明浓度对数与死亡机率单位之间的线性关系均成立，并根据回归方程最终确定了各种药物不同时间的LC50及其95%置信限。图2显示4种中药及甲硝唑不同时间抗结肠小袋虫半数致死浓度的比较，2h的LC50由低到高排序为五倍子、常山、乌梅、二花，6h和12h的LC50排序均为五倍子、乌梅、常山、二花。

表1 常山水提取物对结肠小袋虫的毒性效应Table 1 Toxicity of water extracts from Dichroa febrifugaagainst B.coli

表2 五倍子水提取物对结肠小袋虫的毒性效应Table 2 Toxicity of water extracts fromGalla chinensis against B.coli

表3 乌梅水提取物对结肠小袋虫的毒性效应Table 3 Toxicity of water extracts fromPrunus mume against B.coli

表4 二花水提取物对结肠小袋虫的毒性效应Table 4 Toxicity of water extracts fromLonicera japonica against B.coli

表5 甲硝唑对结肠小袋虫的毒性效应Table 5 Toxicity of metronidazole against B.coli

3 讨论

结肠小袋虫包括滋养体和包囊两个阶段，人及动物食入包囊后，囊壁在消化液作用下被破坏，滋养体脱出，其以结肠及盲肠内的淀粉、细菌及脱落的细胞为食，并以横二分裂法及出芽生殖方式繁殖［8］，当人和动物免疫力下降或肠道黏膜受损时侵入肠黏膜而引起发病［12－13］。药物对滋养体有杀灭作用，而对包囊无效［14］。虽然有文献报道未发现结肠小袋虫对药物有抗性［3］，但有关结肠小袋虫药物敏感性的研究较少，更未见关于中药抗虫浓度的研究。

本试验利用机率单位法，首次检测了4种中药抗结肠小袋虫的半数致死浓度，为应用中药预防控制该虫引起的感染提供了科学依据。试验研究发现，4种中药中，常山的2h和6h的LC50接近，且二者LC50的95%置信限有重叠，说明其对结肠小袋虫的毒性具有较好的速效性。而其他3种中药3个时间的LC50差异较大，且随时间延长，LC50大幅度减小，与甲硝唑的作用类似，没有速效性。LC50越小，说明药物的作用效果越好，五倍子、常山和乌梅的不同时间的LC50均小于相应时间二花的LC50，可作为抗结肠小袋虫候选中药。中药水提取物是多种成分的混和物，在分离出单体之前难以确定是哪一种成分在起作用，也就无从知道其作用方式［9－10］。今后要用多种溶剂提取其有效成分，并进行试验，以确定上述中药抗结肠小袋虫的作用成分及其作用机制，并利用动物试验寻找恰当的剂量和剂型。

图2 不同药物对结肠小袋虫的半数致死浓度比较Fig.2 Comparison of LC50of different medicines against B.coli

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