桑叶提取物在大鼠体内的代谢产物含量测定及其药动学研究

蒋立娣，宣贵达，赵 岚，朱炎斐，楼雪芳

(浙江大学城市学院医学与生命科学学院，浙江 杭州 310015)

桑叶作为传统的中药材之一，具有药性平和、无毒副作用等特点，已经被国家卫生部正式归入“药食同源”之列，引起众多研究者的关注。黄酮类化合物是桑叶中主要的药理活性成分之一，它们含有多个羟基，主要以与葡萄糖、鼠李糖等结合成为糖苷的形式存在。研究表明，绝大多数黄酮苷类化合物口服后，首先在肠道微生物或/及小肠上皮细胞水解酶作用下，转变成相应的黄酮苷元而被吸收，因此，口服黄酮苷类化合物的效应成分多为其苷元［1-3］。综观文献，许多对桑叶黄酮类化合物的研究往往集中在含量测定和药理学研究方面，如抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等［4-6］，而对其在生物体内的含量测定和吸收情况的研究未见文献报道，相关的研究是银杏类药物中黄酮的体内含量测定和生物利用度比较［7-8］。因此，为了探究桑叶提取物效应成分在体内的吸收和代谢情况，为桑叶类药物的临床药代动力学研究提供一定的参考，建立大鼠血浆中槲皮素、山萘酚和异鼠李素的测定方法很有积极意义。在本研究中，我们建立了同时测定大鼠血浆中槲皮素、山萘酚和异鼠李素的高效液相色谱法，并以建立的方法考察了大鼠口服桑叶提取物后各主要代谢产物浓度随时间的变化，以DAS药动学软件计算了统计矩参数。

1 材料和方法

1.1 仪器与试药 Agilent1100高效液相色谱仪，DAD检测器，四元泵，Agilent1100 Chemstation(Agilent公司)。

槲皮素和山萘酚对照品(中国药品生物制品检定所)，异鼠李素和木犀草素对照品(南京泽朗医药科技有限公司，HPLC级，含量≥98%);桑叶提取物(浙江大学药学院药物研究所提供);甲醇为国产色谱纯，其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物 SD大鼠，5只，雄性，180～230 g，清洁级，浙江省实验动物中心提供。

1.3 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇∶0.2% 磷酸 =50∶50(v/v)，流速:1.0 ml/min;检测波长:380 nm;柱温:37℃;进样量:75 μl;内标法定量。

1.4 大鼠血样的采集 大鼠于实验前15 h禁食(自由饮水)，后尾静脉采血0.25 ml作为空白血浆，接着灌胃给药 FME(110 mg/kg)的0.5%CMC-Na混悬液。在分别给药后的0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h，从尾静脉取血约0.25 ml，置于肝素化的离心管中，10000 r/min离心5 min，分离血浆，－20℃冰箱中保存，备用。

1.5 血浆样品预处理 精密移取血浆0.1 ml置10 ml离心管中，精密加入9.996 μg/ml的内标物质木犀草素9.0 μl，漩涡混匀1 min，然后漩涡并缓慢加入浓度为3 mol/L HCl 0.2 ml，90℃水浴中水解1 h，冰浴冷却，冷却后精密加入乙醚-丙酮(14∶1)混合液3.0 ml，漩涡提取5 min，4000 r/min离心10 min，完全移取上清液挥干，残渣加入流动相150 μl，漩涡溶解1 min，13000 r/min 离心 10 min，取上清液 75 μl，HPLC进样分析。

2 结果

2.1 方法选择性 通过调节流动相比例，当甲醇∶0.2%的磷酸为50∶50(v/v)时槲皮素、木犀草素、山萘酚和异鼠李素均达到基线分离。空白血浆、空白血浆+对照品以及给药后血浆样品的HPLC图谱见图1。由图可知，空白血浆在槲皮素、木犀草素、山萘酚和异鼠李素保留时间处均无干扰峰，说明血浆内源性物质不影响本实验的测定，即本方法具有较好的选择性。

图1 大鼠血浆HPLC图谱Fig.1 Representative HPLC chromatograms of rat plasma

2.2 标准曲线与定量下限 精密移取对照品溶液适量于离心管中，以空白血浆配成含槲皮素、山萘酚和异鼠李素的浓度分别在0.0545～8.73 μg/ml、0.0954 ～ 14.7 μg/ml、0.0545 ～8.55 μg/ml间的7个不同浓度的标准含药血浆质控样品，每一浓度3份，按“1.5”项下操作。以药物与木犀草素峰面积的比值为纵坐标(Y)，药物浓度为横坐标(X)，进行线性回归，获得槲皮素、山萘酚和异鼠李素的回归方程分别为:y1=0.3724x1+0.157(r=0.9979);y2=0.568x2－0.0444(r=0.9993);y3=0.4042x3－0.0179(r=0.9981)。表明槲皮素在0.0545～8.73 μg/ml，山萘酚在 0.0954 ～14.7 μg/ml，异鼠李素在0.0545～8.55 μg/ml范围内线性良好。槲皮素、山萘酚和异鼠李素的定量下限(LOQ)分别为 0.0545、0.0954和 0.0545 μg/ml。

2.3 回收率 精密移取对照品溶液适量于离心管中，以空白血浆配成含槲皮素、山萘酚及异鼠李素的浓度为(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的质控样品，每一质量浓度制备5份样品，按“1.5”项下操作。以槲皮素、山萘酚、异鼠李素及内标与相同药物浓度条件下纯溶剂样品对照样本进样后得到的峰面积进行比较，计算提取回收率;以槲皮素、山萘酚和异鼠李素与内标峰面积的比值代入随行标准曲线求得各质量浓度测定值，与加入量比较计算方法回收率，结果见表1。

结果表明，高、中、低3个质量浓度下槲皮素和山萘酚的绝对回收率均高于79.4%，但低浓度下异鼠李素的绝对回收率为62.8%，偏低;三者的方法回收率均在94.7% ～107% 。

2.4 方法精密度 精密移取对照品溶液适量于离心管中，以空白血浆配成含槲皮素、山萘酚及异鼠李素的浓度为(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的质控样品，每一质量浓度制备5份样品，按“1.5”项下操作，记录槲皮素、山萘酚及异鼠李素与木犀草素的峰面积比值，代入标准曲线求得各质控样品的浓度值。计算日内精密度RSD和5 d内的日间精密度RSD，结果见表2。

表1 槲皮素、山萘酚和异鼠李素的回收率Table 1 Recoveries of extraction and assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

表2 槲皮素、山萘酚和异鼠李素的方法精密度Table 2 Presicion of assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

从表2中可知，槲皮素、山萘酚及异鼠李素的日内和日间精密度RSD分别小于9.5%和9.8%，表明该方法准确、精密，重复性较好。

2.5 样品稳定性 精密移取对照品溶液适量于离心管中，以空白血浆配制高、低浓度的质控样品，其中槲皮素(0.300，6.53)μg/ml、山萘酚(0.525，11.0)μg/ml、异鼠李素(0.300，6.56)μg/ml。每一质量浓度3份样品，按“1.5”项下操作，分别于室温 0、4、8 h 及 －20℃ 3、7、15 h以及解冻冻融1、2、3次后测定，记录槲皮素、山萘酚和异鼠李素与木犀草素的峰面积的比值，代入标准曲线求得各质控样品的浓度值，并与同浓度0 h质控样品比较后计算回收率。

结果表明，样品在－20℃冷冻15 d后三者含量均在90.4% ～103%内，稳定性良好。而在室温条件下，山萘酚稳定性良好，8 h后，高低浓度下的回收率分别为75.8%和80.8%;异鼠李素的稳定性不及山萘酚，8 h后，高浓度下的回收率仅为60.0%;槲皮素的稳定性明显欠缺，8 h后，高低浓度下的回收率均低于50%，提示样品不宜在室温条件下长时间置放。结果也表明，经过2次冻融解冻过程后，待测成分各浓度均在初始浓度的85.5% ～96.7%内，但经过3次冻融，槲皮素高低浓度下、异鼠李素低浓度下的浓度降低较多，仅为初始浓度的74.6%～77.4%，提示实际测定时样品最多进行2次冻融。

2.6 大鼠体内的药动学 大鼠灌胃给药FME(110 mg/kg)，收集给药前及给药后0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h 时间点血浆。通过建立的HPLC方法，测定不同时间点血浆中槲皮素、山萘酚及异鼠李素的总浓度，利用DAS软件，计算统计矩参数，结果见表3和图2。

表3 大鼠口服桑叶提取物后血浆中槲皮素、山萘酚及异鼠李素的药动学参数Table 3 Pharmacokinetic parameters of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in rat plasma after oral administration of FME(n=5)

由图2可见，大鼠灌胃给药(110 mg/kg)FME后槲皮素、山萘酚及异鼠李素迅速达到一个峰浓度，6 h左右，山萘酚和异鼠李素第二次达到峰浓度;同时，由表3可知，三者的T1/2z分别为 92.7，67.9 和54.2 h。这提示三者在大鼠体内分布非常迅速，而滞留非常久长。

3 讨论

考虑到槲皮素、其它的黄酮类或异黄酮在血浆和尿液中多以甲基化/葡糖醛酸化/硫酸化的结合物形式存在，大鼠血浆中槲皮素、山萘酚及异鼠李素很可能是以游离和结合两种形式并存。因此，本研究将给药后血浆水解再进行测定，使三者的葡萄糖醛酸、硫酸酯以及其他结合物均能水解成游离的单体，进而测定各代谢产物的总浓度。研究用单因素考察的方法考察了盐酸浓度、水浴温度和水解时间对水解结果的影响，结果表明，盐酸浓度为3 mol/L，水浴温度为90℃，水解时间为60 min时，各代谢产物的提取效率较为理想。

图2 大鼠口服FME(110 mg/kg)后的平均血浆药物浓度-时间曲线Fig.2 The plasma concentration-time curve of quercetin，kaempferol and isorham-netin in rats after oral administration of FME(110 mg/kg).Data are expressed as mean±SD(n=5)

在内标的选择中，我们曾采用芹菜素，但芹菜素出峰时间较晚。后考虑到木犀草素结构与被测物相似，根据文献［9］，其油水分配系数(1ogP)为 2.30，介于槲皮素(2.10)和山萘酚(2.50)之间，分析其保留时间可能也在两者之间，且我们在做桑叶提取物水解槲皮素和山萘酚含量测定［10］时，在本研究流动相条件下，并未检测出木犀草素。实验证实，木犀草素的保留时间恰好落在槲皮素和山萘酚之间，槲皮素、山萘酚、异鼠李素和木犀草素的绝对回收率相差接近10%，符合内标法测定的要求。

本研究中，药动学结果提示，槲皮素、山萘酚和异鼠李素在大鼠体内的分布迅速，而滞留久长。研究同时显示，山萘酚和异鼠李素出现双峰现象，这和文献报道一致，可能是存在肝肠循环，引起血浆浓度的再次集结。结果也提示，大鼠口服的剂量可能偏高，致使各代谢产物的终末相半衰期远大于文献报道。同时我们也认为，本研究的药物为桑叶提取物，组成成分之间的相互作用可能会使吸收、分布、代谢等转运环节发生变化，也有可能其中的其它成分在体内的代谢与效应成分的代谢一致，致使循环吸收和消除相半衰期延长。但桑叶是一种无毒副作用的传统中药材，血浆中长时间较高的药物浓度，更有利于其生物利用度的提高和药效作用。

［1］CHOOI Y L，HWEE M C，SI M S.Mulberry leaves protectrattissues from immobilization stressinduced inflammation ［J］.BioFactors，2007，31:25-33.

［2］THOMAS W.Absorption and metabolism of flavonoids［J］.Free RadicalBiology and Medicine，2004，36(7):830-831.

［3］KIM D H，KIM S Y，PARK S Y.Metabolism of quercetin by human intestinal bacteria and its relation to some biological activity ［J］.Biological＆PharmaceuticalBulletin，1999，22(7):749-751.

［4］JIANG Yu-lan，PIAO Hui-shan，LI Gao(姜玉兰 ，朴惠善，李 镐).Study on antioxidant activity of constituents from mulberry leaf［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials(中药材)，2008，31(4):519-522.(in Chinese)

［5］ZHU Yu-xia，ZOU De-ping，LIU Xue-peng，et al .(朱玉霞，邹德平，刘学鹏，等).Effects of mulberry leaves flavonoids on insulin resistance in type 2 diabetic rat［J］.Sichuan Medical Journal(四川医学)，2008，29(9):1114-1116.(in Chinese)

［6］XIE Hui-ping，LIU Yi-nong，GUO Ming(谢惠萍，刘以农，郭 明).Experimental study of the mulberry leaf extracts's effect on blood lipids［J］.Modern Medicine Journal of China(中国现代医药杂志)，2006，8(11):48-49.(in Chinese)

［7］CHEN Z P，SUN J，CHEN J.Comparative pharmacokinetics and bioavailability studies of quercetin，kaempferol and isorhamnetin after oral administration of Ginkgo biloba extracts，Ginkgo biloba extract phospholipid complexes and Ginkgo biloba extractsolid dispersionsin rats ［J］.Fitoterapia，2010，81:1045-1052.

［8］HUANG Min-wen，WANG Guang-ji，LI Hao，et al(黄敏文，王广基，李 昊，等).Simultaneous determination of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in dog plasma by HPLC-MS/MS，［J］.Chinese Journal Clinical Pharmacology Therapeutics(中国临床药理学与治疗学)，2008，13:1330-1339.(in Chinese)

［9］XIA Man-li，GAO Qin，ZHOU Xin-mei，et al(夏满莉，高 琴，周新妹，等).Vascular effect of extract from mulberry leaves and underlying mechanism［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大学学报:医学版)，2007，36(1):48-53.(in Chinese)

［10］JIANG Li-di.，XUAN Gui-da，WU Hao-hao(蒋立娣，宣贵达，吴好好)Determination of quercetin and kaempferolin Folium MoriExtractafter hydrolysis by hydrochloric acid ［J］.Journal of Zhejiang University:Science Edition(浙江大学学报:理学版)，2009，36(1):704-707.(in Chinese)