黄芪皂甙Ⅳ对大鼠脑缺血/再灌注损伤海马神经元凋亡及Livin、Caspase-9、Caspase-3表达的影响

王 莹,李文媛,李明秋,丁 利,管业秋,赵斯达

(牡丹江医学院解剖教研室,黑龙江牡丹江157011)

脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血最关键的方法,但再灌注后可加重缺血脑组织的损伤,这种损伤以凋亡为主,因此减少缺血/再灌注后神经元凋亡为重要的脑保护机制。细胞凋亡线粒体通路中重要酶Caspase-9和Caspase-3在线粒体介导的细胞凋亡中起着重要的作用[1]。通过干预线粒体通路,可阻断细胞凋亡的进程。Livin作为一种新发现的凋亡抑制蛋白(IAP)能够干预线粒体通路,发挥抑制细胞凋亡的作用[2]。但对于Livin、Caspase-9和Caspase-3在脑缺血再灌注损伤中的作用研究较少。黄芪皂甙Ⅳ是一种纯化小分子皂甙(分子量784),作为黄芪的主要活性成分,已被广泛的应用于缺血性脑血管病的治疗[3],能够促进脑缺血损伤的神经功能恢复。但关于黄芪皂甙Ⅳ在脑缺血中抑制细胞凋亡的机制研究尚不明确。本研究通过建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,观察黄芪皂甙Ⅳ对大鼠海马区神经细胞凋亡及Livin、caspase-9、caspase-3表达的影响,探讨黄芪皂甙Ⅳ抑制细胞凋亡的作用机制,为黄芪皂甙Ⅳ临床治疗脑缺血再灌注损伤提供新的实验依据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠42只,清洁级,体质量280～320 g,购于中国医科大学实验动物中心(许可证号:SYXK[辽]2003-0013)。

1.2 试剂与药物 黄芪皂甙Ⅳ(西安赛邦医药),纯度98%。用时以生理盐水配成质量浓度1.0 mg/mL。尼莫地平注射液(河北医科大学制药厂),20 mg/100 mL,用时以生理盐水配成质量浓度为0.1 mg/mL。Livin、Caspase-9和Caspase-3多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒、TUNEL试剂盒购于北京中山生物试剂公司;TRI-zol试剂、SuperscriptII反转录酶、dNTPs购自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、DL 2000 DNA标志物购自Takara公司;Livin、Caspase-9、Caspase-3和β-actin引物由大连宝生物合成。

1.3 动物模型制备与分组 大鼠按体质量分层,随机分为4组:假手术组(n=6)、模型组(n=12)、尼莫地平对照组(n=12)、黄芪皂甙Ⅳ组(n=12)。参照宫健伟等[5]的线栓改良法复制大鼠左侧大脑MCAO脑缺血模型。各组于缺血前5 min第1次给药,腹腔注射,缺血后12、24、48 h给药3次,共给药4次。黄芪皂甙Ⅳ给药剂量为20 mg/kg,尼莫地平注射液给药剂量为1 mg/kg,均为临床等效剂量。假手术组和模型组给予等体积生理盐水。术后当日给大鼠饮水,次日开始自由饮食。

1.4 神经功能评估 采用Chen等[6]报道的神经功能损害评分表(neurological severity scores,NSS),从运动、感觉、反射、平衡4方面进行神经功能损害评估,22分为最严重的神经功能损害,即评分越高神经功能损害越严重。缺血后3 d各组大鼠分别进行NSS评分。

1.5 免疫组织化学检测 缺血后3 d,取脑组织行冰冻切片,在视交叉后1～4 mm处冠状切面切开,在海马齿状平面连续冠状切片,片厚4 μ m。组织薄片以PBS漂洗2次,0.5%过氧化氢孵育10 min;PBS漂洗3次,正常山羊血清37℃孵育15 min后,滴加稀释后的一抗Livin(1∶100)、Caspase-3(1∶150),Caspase-9(1∶150),4℃过夜。滴加生物素标记体,30 min,37℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37℃,30 min。DAB显色液显色。苏木精复染,以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片,400倍光镜下每张切片在海马随机选5个视野,用计算机图像分析系统(HPIAS-1000)对各组阳性细胞进行IOD值分析。

1.6 凋亡神经元的检测 采用原位末端TUNEL标记法检测。将甲醛固定大鼠海马组织标本常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚4 μ m,脱蜡后按照In situ-Apoptosis Detection Kit说明书操作;阴性对照采用pH 7.2～7.6,0.01 mol/L PBS代替TUNEL反应液。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片,每张切片在海马随机选5个视野,400倍光镜下应用目镜阳性细胞所占的百分比。细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)=凋亡阳性细胞总数/细胞总数。

1.7 实时荧光定量PCR检测

1.7.1 总RNA提取 每组取6只在水合氯醛麻醉下,经心脏灌流焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的生理盐水,以冲净血液。取大鼠缺血侧海马区脑组织50mg,置于液氮中冷冻,采用Trizol法提取总RNA。进行RNA纯度鉴定。

1.7.2 采用嵌合荧光检测法 以OLIGO六聚体为逆转录引物,以提取的总RNA为模板,在AMV催化下反转录出cDNA。根据TAKARA Real time PCR试剂盒与扩增仪说明,采用50 μ L反应体系:引物设计及合成按照已报道的序列设计并合成Livin、Caspase-3、Caspase-9以及内参照β肌动蛋白β-actin的特异性引物。各引物的序列为:Livin:上游5'-CTGGGACCCGTGGGAAGAAC-3',下游5'-TCCTGGGCACTTTCAGAC TG-3',169bp。Caspase-3:上游5'-AATTCAAGGGACGGG TCATG-3',下游5'-GCTTGTGCGCGTACAGTTTC-3',100 bp。Caspase-9:上游5'-CCAGATGCTGTCCCAT ACC-3',下游5'-ATTGGCGACCCTGAGAAG-3',228bp。β-actin:上游5'-TGGTGGGT ATGGGTCAGAAGGACTC-3',下游5'-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3',265 bp。总反应体系包括cDNA 4 μ L,1 mmol/LdNTPs 10 μ L,10 xTaq聚合酶buffer 5 μ L,上下游引物各2 μ L(10 pmol/L),Mg2+3 μ L,去离子水18 μ L,TaqTM 25 μ L,放入Light Cycler定量PCR反应仪,反应条件:变性94℃30 s,退火54℃45 s,延伸72℃45 s,反应循环数为45,依据标准定量曲线对PCR产物定量分析。

1.7.3 每个标本扩增Livin、Caspase-3、Caspase-9基因同时都扩增β-actin为对照,每次扩增均设置pGEM-TCaspase3,pGEM-T-Caspase9,pGEM-T-β-actin,pGEM-TLivin质粒标准曲线;记录标本CT值,首先以各组标准曲线CT值,回归出各自的回归方程(Livin、Caspase-3,Caspase-9,β-actin),再由回归方程计算出各标本的目的基因表达量,计算出Livin、Caspase-3、Caspase-9和β-actin的平均CT值以及△CT值,通过2ΔΔCt方法进行相对定量。

1.8 统计学处理 所得数据均采用SPSS 13.0软件进行分析,连续型变量采用均值±标准差(±s)表示,多组间均数比较用单因素方差分析,2组间均数比较方差齐时用LSD法,方差不齐时用Games-Howell法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 假手术组神经功能损害评分值为0,无神经功能损害。黄芪皂甙Ⅳ组(8.21±0.89)分,其神经功能损害评分低于模型组(10.06±0.96)分和尼莫地平组(11.06±0.96)分,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 免疫组织化学染色和TUNEL染色 Livin、Caspase-3、Caspase-9阳性细胞胞质着色,呈棕黄色或棕褐色。假手术组海马中未见Caspase-3、Caspase-9蛋白表达,Livin蛋白有少量表达。模型组Livin蛋白也表达很少,与假手术组比较无统计学意义(P＞0.05),但Caspase-9和Caspase-3蛋白表达较假手术组显著增加(P＜0.05)。与模型组和尼莫地平对照组比较,黄芪皂甙Ⅳ组Livin蛋白表达显著增高(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3蛋白表达显著下降(P＜0.05)。假手术组脑组织未见细胞凋亡。模型组、尼莫地平对照组、黄芪皂甙Ⅳ组均可见到海马区细胞凋亡,凋亡细胞胞质呈棕褐色,黄芪皂甙Ⅳ组凋亡指数明显少于模型组和尼莫地平组,差别有统计学意义(P＜0.05),见表1。

2.3 实时荧光定量RT-PCR的扩增效率检测 假手术组海马区中未见Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达,Livin mRNA表达较少,模型组Livin mRNA表达较假手术组无统计学意义,但Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达较假手术组比较(P＜0.05)。与模型组和尼莫地平对照组比较,黄芪皂甙Ⅳ组Livin mRNA表达显著增高(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达显著下降(P＜0.05),见表2。

3 讨论

脑缺血性损伤的机制和防治一直是该领域研究的热点[7],海马神经元对缺血具有选择性敏感,短暂性脑缺血即可导致该区神经元的迟发性死亡(DND),所以海马成为缺血性脑损伤研究的一个典型脑区。随着研究的深入,人们发现短暂脑缺血后海马出现DND与细胞凋亡密切相关。目前研究发现,脑缺血神经元凋亡受多种基因调控。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白激酶家族(Caspase)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶,迄今为止这一家族至少有14个成员,其中Caspase-9、Caspase-3是细胞凋亡线粒体通路中最重要的蛋白酶。线粒体通路是指氧自由基、钙超载等凋亡刺激因素使线粒体通透性增加,线粒体跨膜电位下降,释放细胞色素C(CytoC),CytoC主要激活Caspase-9进而也激活下游的Caspase-3,诱导细胞凋亡[8]。而Livin作为一个新的凋亡抑制蛋白能够作用于线粒体途径,可以直接与Caspase-9前体蛋白(proCaspase-9)和其激活形式结合从而抑制其活性,还可以直接结合并抑制Caspase-3的活性,阻断他们依次裂解激活,同时阻断了Caspase-3对proCaspase-9的反馈激活,抑制细胞的调亡[9]。本研究发现,假手术组大鼠脑组织未见细胞凋亡、Caspase-9和Caspase-3的表达,Livin表达很少。模型组可见到海马神经元细胞凋亡,Caspase-9、Caspase-3显著表达(P＜0.05),且与凋亡分布一致。但模型组Livin表达较少,我们推测可能与脑缺血损伤后Caspase-9和Caspase-3表达增强并与之结合有关。

表1 海马区神经元细胞凋亡指数及Livin、Caspase-9、Caspase-3蛋白平均光密度值(OD)比较(±s,n=6)

表1 海马区神经元细胞凋亡指数及Livin、Caspase-9、Caspase-3蛋白平均光密度值(OD)比较(±s,n=6)

注:与假手术组比较,##P＜0.01;与模型组比较,△P＜0.05。

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表2 海马区Livin、Caspase-9、Caspase-3 mR NA相对表达(2-Δ ΔCt值)比较(±s,n=6)

表2 海马区Livin、Caspase-9、Caspase-3 mR NA相对表达(2-Δ ΔCt值)比较(±s,n=6)

注:与假手术组比较,##P＜0.01;与模型组比较,△P＜0.05。

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本实验中,黄芪皂甙Ⅳ组的神经功能恢复明显优于尼莫地平对照组和模型组,提示黄芪皂甙Ⅳ具有神经保护作用,这为黄芪皂甙Ⅳ治疗缺血性脑损伤提供了行为学上的实验依据。尽管黄芪皂甙Ⅳ在脑缺血损伤条件下能够发挥多种作用,但其在脑缺血再灌注后对细胞凋亡的作用机制仍不明确。本实验结果表明,与尼莫地平对照组和模型组相比较,黄芪皂甙Ⅳ能明显上调Livin表达,下调Caspase-9和Caspase-3表达,降低神经元细胞凋亡指数。但Caspase-9、Caspase-3表达下调是由于黄芪皂甙Ⅳ直接抑制Caspase-3和Caspase-9表达,还是因黄芪皂甙Ⅳ上调Livin从而抑制Caspase-9、Caspase-3活性所致,仍有待进一步研究。

综上所述,黄芪皂甙Ⅳ可能通过上调海马区Livin表达,下调Caspase-9和Caspase-3表达,抑制细胞凋亡线粒体途径,来减少脑缺血后神经元凋亡,对脑缺血损伤发挥保护作用。

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