慢性乙型肝炎和肝硬化患者外周血单个核细胞分泌TIMP-1的研究

王恩波,丁荣梅,李兴华

(连云港市第一人民医院输血科,江苏连云港222002)

本研究通过对慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清和单个核细胞中组织金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的分析,探讨TIMP-1在肝纤维化中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 病例的选择 病例组为2006年7月至2008年7月在我院住院的患者,慢性乙型肝炎63例,其中男42例,女21例,平均年龄39(20-69)岁;乙型肝炎肝硬化47例,男27 例,女 20例,平均年龄56(41-77)岁,诊断按2000年9月中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的标准进行临床分型,所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒合并感染。对照组是体检健康且乙型肝炎标志物阴性40例,男25例,女15例,平均年龄35(27-48)岁。

1.2 主要试剂和仪器 Ficoll淋巴细胞分离液购于CEDARLANE,1640细胞培养液购于GIBCO,胎牛血清购于杭州四季青公司,刀豆蛋白A(ConA)购于SIGMA公司,组织金属蛋白酶抑因子1和转化生长因子β1 ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。MCO-17AC CO2培养箱(SANYO)。

1.3 外周血单个核细胞的分离和培养 抽取健康对照、慢性乙型肝炎和肝硬化患者静脉血5 ml,应用Ficoll分离液密度梯度离心分离PBMC,用1640培养基洗涤PBMC3次,每次800 rpm/min离心10分钟,用1640培养基调整细胞浓度至2×106/ml,取细胞悬液加入96孔平底细胞培养板中,200 μ l/孔,每个标本加3个复孔,每孔加入刀豆蛋白A至终浓度5 μ g/μ l,37℃5%CO2培养箱中共同孵育72 h后,收集细胞培养上清液检测TIMP-1的含量。

1.4 血清TIMP-1、TGF-β1和细胞培养上清液中TIMP-1的含量检测 应用博士德人组织金属蛋白酶抑因子1 ELISA试剂盒检测血清和细胞培养上清液中TIMP-1的含量,博士德人转化生长因子β1 ELISA试剂盒检测血清TGF-β1的含量。

1.5 统计学分析 数据应用SPSS14.0统计软件包分析处理,均数的比较采用两独立样本t检验,数据以±s表示;PBMC中 TIMP-1含量与血清TGF-β1的关系采用二元变量的相关分析。

2 结果

2.1 血清和PBMC培养上清中TIMP-1蛋白含量的比较 见表1。

表1 血清和PBMC培养上清中TIMP-1蛋白含量

2.2 血清 TGF-β1含量、血清 TIMP-1与 TGF-β1含量相关性分析 慢性乙型肝炎组(12.05±2.62)ng/ml和肝硬化组(13.91±3.04)ng/ml两组血清TGF-β1蛋白含量均明显高于正常对照组(6.15±2.31)ng/ml;血清TIMP-1与TGF-β1含量呈明显正相关(r=0.71,P＜0.01)。

3 讨论

慢性乙型肝炎病人血清TIMP-1升高主要是由于长期慢性肝脏炎症,TGF-β1、IL-1、TNF-α等合成和分泌增加,这些炎症因子促使了TIMP-1的表达,尤其是肝脏损伤时,肝星状细胞(HSC)通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的TGF-β1,激活的TGF-β1通过与细胞膜上的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体结合发挥作用,促使Ⅰ、Ⅲ型胶原,纤维连接蛋白及其mRNA均呈剂量依赖性增加,同时TGF-β1通过促进HSC分泌TIMP-1抑制胶原酶的mRNA的表达进而减少ECM的分解,在我们检测的慢性肝脏病病人中,血清TGF-β1含量明显增高。张连峰[1]等人检测了慢性乙型肝炎患者血清TGF-β1和TIMP-1在肝纤维化不同阶段的表达情况,通过肝穿刺对肝纤维化进行病理分级,发现血清TGF-β1、TIMP-1在肝纤维化早期即明显升高,且随肝纤维化程度的加重 TGF-β1、TIMP-1逐渐升高,因此认为血清TIMP-1含量对肝纤维化的诊断中具有较高的价值。Fontana[2]等人建立了包含血清TIMP-1、HA和血小板个数的三变量数学模型,在诊断肝硬化时,ROC曲线下面积达到0.81,诊断价值明显优于APRI(曲线下面积为0.73)和肝硬化积分(曲线下面积为0.70)等模型,多变量分析提示血清TIMP-1、HA含量与肝脏纤维化Ishak积分呈正相关,血清TIMP-1、HA与肝脏胶原直接定量分析相比更能准确的反应肝脏纤维化的程度。

对外周血单个核细胞培养上清液TIMP-1含量检测表明,单个核细胞合成的TIMP-1含量较低,且慢性乙型肝炎和肝硬化组单个核细胞培养上清TIMP-1含量与正常组比较,差别无显著性意义,进一步证明血清中的TIMP-1主要来源于活化的HSC,对大鼠慢性肝损伤的研究表明[3],TIMP-1的持续高表达与HSC的持续激活相关。总之,在慢性肝脏疾病患者中,外周血单个核细胞分泌的TIMP-1未发生明显改变,而血清TIMP-1水平有助于肝脏纤维化的诊断。

[1]张连峰,田笑笑,王春峰.转化生长因子β1和基质金属蛋白酶抑制因子-1在肝纤维化诊断中的作用及关系[J].中华肝脏病杂志,2007,15(4):258.

[2]Fontana RJ,Goodman ZD,Dienstag JL,et al.Relationship of serum fibrosis markers with liver fibrosis stage and collagen content in patients with advanced chronic hepatitis C[J].Hepatology,2008,47(3):789.

[3]Iredale JP,Benyon RC,Arthur MJ,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 messenger RNA expression is enhanced relative to interstitial collagenase messenger RNA in experimental liver injury and fibrosis[J].Hepatology,1996,24(1):176.