肺结核患者外周血CD4CDT细胞的临床意义初探

张青 肖和平 粟波

(同济大学附属上海市肺科医院同济大学医学院 上海 200433)

张青 肖和平 粟波

(同济大学附属上海市肺科医院同济大学医学院 上海 200433)

目的通过测定肺结核患者外周血CD4CDT细胞的表达,探讨CD4CDT细胞的的临床意义>。方法2008年1月至2010年2月选取住院患者及门诊做体检的健康志愿者共78例,其中肺结核患者40例,门诊健康志愿者38例,应用流式细胞技术测定外周血 T细胞表面分子CD4、CD8、CD4CD,以百分比表示表面分子阳性T细胞占淋巴细胞的比例>。结果外周血CD4CDT细胞,肺结核组(1.9%±1.3%)明显高于健康组(0.7%±1.0%),差异有统计学意义(t=5.237,P＜0.01)。外周血CD4T细胞,肺结核组(47.9%±11.2%)低于健康组(56.0%±14.6%),差异有统计学意义(t=2.830,P＜0.01)。外周血CD8T细胞,肺结核组(26.2%±6.1%)低于健康组(33.0%±11.1%),差异无统计学意义(t=0.353,P＞0.05)。肺结核患者治疗2月后,CD4CDT细胞(1.8%±0.8%)有下降,但与治疗前比较差异无统计学意义(t=0.811,P＞0.05)。CD4T细胞、CD8T细胞均有升高(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%),但差异无统计学意义(t值分别为=1.496,0.570,均P＞0.05)>。结论CD4CDT细胞参与了肺结核患者的细胞免疫过程,发挥抑制CD4和CD8T细胞的活化与增殖的作用,从而影响了患者的临床演变及预后。

结核,肺/血液;T淋巴细胞;流式细胞术

肺结核患者的临床表现主要取决于宿主Th1/Th2免疫反应,T h1反应通过形成肉芽肿来遏制结核分枝杆菌生长[1],Th2反应不但无法遏制结核分枝杆菌,还会导致细菌播散,形成空洞,肺部组织毁损等重症肺结核,患者不但临床症状严重,影像学也往往表现为多个大小不一的空洞及肺组织的广泛浸润,使治疗非常棘手。机体T细胞反应强度取决于宿主的免疫调节能力。近来,调节性 T细胞(T reg)逐渐被现代免疫学者所重视并研究[2-3],这类细胞可以抑制周边效应 T细胞(Teff)的功能,并且主要通过释放抑制性细胞因子(如白细胞介素-10,肿瘤生长因子-β)或通过细胞接触机制加以实现[4]。虽然它的表型各家报道不一,但几个研究都认为CD4CD是调节性T细胞较明确的表型[5-7]。同时,调节性T细胞也表达特有的趋化因子,可诱导其自身迁徙至病灶部位,下调效应 T细胞的功能。因此,调节性T细胞参与了结核分枝杆菌胞内感染的免疫防御过程,但是它在肺结核患者中的变化还不清楚。

1 资料和方法

1.1 研究对象 受试者为2008年1月至2010年2月住院的肺结核患者及门诊体检志愿者共78例,其中男59例,女 29例,年龄18～71岁,平均(40±13)岁,体质量指数＞18.5 kg/m2。

1.1.1 分组 (1)初治肺结核患者(简称“肺结核组”)40例,共筛选符合诊断标准的肺结核患者42例,1例痰分枝杆菌药敏结果为耐多药肺结核,1例合并干燥综合征,故被排除。余40例用于本研究,其中男28例,女12例,平均年龄(41±15)岁。(2)同期选取在门诊做体检的健康志愿者38例(简称健康组),共筛选了40例,1例PPD阳性,1例血糖升高,均被排除,余 38例用于本研究,其中男21例,女17例,平均年龄(40±11)岁。他们的X线胸片未见异常,否认有结核病史,无严重心、肝、肾、过敏性疾病史及其他超敏反应性疾病史,未服用过任何糖皮质激素及其他免疫抑制剂。

1.1.2 诊断标准 初治肺结核的诊断参照《临床诊疗手册·结核病分册》[8],并且痰分枝杆菌涂片检查至少2次阳性。结核分枝杆菌素试验采用5个国际单位结核分枝杆菌纯蛋白衍生物[9],硬结＜5 mm判断为阴性。

1.1.3 排除标准 合并免疫系统相关疾病、肿瘤的患者;痰分枝杆菌培养结果为非结核分枝杆菌生长的患者;药物敏感试验提示为耐多药结核病患者;HIV阳性患者;PPD阳性的健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 CD4-ECD、CD8-ECD、CD25-FITC单克隆抗体,试剂生产商为Beckman Coulter Immuntech SAS(13276 Marseille Cedex 9,France),以及Beckman Coulter Cytomics FC500流式细胞仪(Beckman Coulter公司,美国)。

1.2.2 试验方法 40例肺结核患者签署知情同意书,在抗结核治疗前及治疗后2月用流式细胞仪测定外周血CD4、CD8、CD4CDT细胞的表达率。健康者仅测定 1次外周血CD4、CD8、CD4CDT细胞。采用肝素抗凝全血进行荧光标记,100 μ L全血分别先后加入CD4-ECD、CD8-ECD、CD25-FITC抗体室温下孵育30 min,加0.5 ml OptiLyse C溶血素(Coulter公司,法国)溶血,2 000 rpm 离心,加0.5 ml PBS洗涤重悬细胞待流式细胞仪分析。流式分析方案：在FS-SS双参数图上设门选定淋巴细胞群,在CD4-CD25双参数图上检测双阳性细胞。CD25高表达的细胞群设定为CD,见图1。采集软件用 CXP Cytometer,分析软件用CXP Analysis。

1.2.3 质量控制 质控管内加入同型对照抗体IgG-ECD/IgG-FITC。

1.3 统计学处理 数据结果采用x ±s描述。用SPSS13.0统计软件进行分析,2组间均值的比较用Student's t检验,配对资料用配对t检验,构成比采用Person χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 CD4-CD25双参数图

2 结果

2.1 一般情况 2组受试者的一般情况见表1。年龄、性别构成比及身高体质量指数(BMI)在2组间差异无统计学意义(均P＞0.05),具有可比性。

表1 2组受试者的一般情况

2.3 治疗前后T细胞亚群表达率的比较 40例肺结核患者治疗 2月后复查外周血 CD4、CD8、CD4CDT细胞,与治疗前比较的结果见表3。治疗2月后CD4CDT细胞(1.8%±0.8%)有下降,但与治疗前比较差异无统计学意义(t=0.811,P＞0.05)。CD4T细胞、CD8T细胞均有升高(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%),但差异无统计学意义(t值分别为=1.496,0.570,均P＞0.05)。

表2 2组受试者T细胞亚群表达率的比较(%)

表3 肺结核患者治疗前后T细胞亚群表达率的比较(%)

3 讨论

Th1型免疫反应是控制结核分枝杆菌生长所必须的基本条件[10],效应T细胞在化学因子及其他趋化分子的驱动下做选择性迁徙,干预疾病的细胞免疫类型和强弱程度,使结核患者的免疫病理、临床表现各不相同。Walrath J等[11]的研究表明,T h1、Th2型免疫反应直接影响疾病的临床严重程度,比如可表现为局限或是播散或形成空洞。Th1、Th2型效应细胞在体内的选择性迁徙成为局部免疫的关键。但是,肺结核病人的免疫调节机制除了上述重要因素外,还存在其他疑点,尚未得到最终结论。

近10年来先后发现了很多不同来源的T细胞,其中针对效应T细胞发生作用的一类特殊T细胞亚群即调节性T细胞逐渐引起了研究者的关注。这类细胞即可通过抑制免疫反应缓解疾病,如自身免疫疾病和移植排斥[12],也可加速病理条件恶化,阻碍免疫反应,削弱宿主对病理过程的控制能力,如肿瘤和黑热病[13]。本研究的结果提示肺结核患者外周血CD4CDhigh25T细胞含量明显高于健康人,说明肺结核病人存在着由调节性T细胞所致的免疫抑制。我们推测肺结核患者外周血中的调节性T细胞不仅存在于血液循环系统,还有很大一部分迁移至病灶部位,因为CD4CD25+T细胞在炎症因子和淋巴因子作用下特异性表达趋化因子受体CCR4和CCR8,与树突状细胞及吞噬细胞分泌的CCL17和CCL22趋化因子结合,引导CD4CD25+T细胞向炎症部位和次级淋巴组织迁徙来阻止CD4CD25-T细胞的活化[14]。尽管效应T细胞也在化学因子的作用下迁徙到病灶部位,但由于调节性T细胞可以发挥更强的抑制作用,使效应T细胞不足以提供有效的免疫保护,进而Th1型效应T细胞被抑制,机体失去了阻止疾病恶化的能力。体外试验结果表明,将CD4CDhigh25T细胞从活动性结核病患者外周血中剥夺后,再用分枝杆菌抗原刺激,外周血细胞分泌更多的干扰素-γ,而结核潜伏感染和健康人无此现象[15],说明CD4CDT细胞只在结核病活动期下调T细胞反应。因此,结核病人的细胞免疫与CD4CDT细胞密切相关。

本文的结果还提示,肺结核患者与健康对照者比较,外周血的CD4CD调节性T细胞明显升高,而CD4T细胞数量明显减低,CD8T细胞数量也略低,在抗结核治疗2月后,上述指标均有所恢复,说明CD4CDT细胞发挥了抑制CD4和CD8T细胞的活化与增殖的作用,与某些报道一致[7,16]。但因本研究治疗的时间较短,所观察的指标在治疗前后的差异尚无统计学意义,随着治疗的不断延续,肺结核患者的免疫抑制将逐渐改善。本研究之所以测定以CD4CD为表型的调节性T细胞,是为了使其具有更好的同源性。早期的某些研究都用CD4CD25双阳性来代表调节性T细胞,但引发了很多人的质疑,因为有些活化的T细胞表面也同样表达CD25,所以单纯CD4CD25+不能反映调节性T细胞的真正含量。

本研究的不足之处在于未能进行CD4CD25+T细胞的转录因子FOXP3或其mRNA的检测,因此无法深入了解CD4CD25+T细胞的细胞水平及功能活性。

由上提示Treg参与了肺结核患者的细胞免疫过程,与Teff同样发挥着重要作用,可以推动免疫向促炎方向发展,或是向免疫抑制方向发展,从而影响了肺结核患者的临床演变及预后。

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Clinical significance of CD4CDT cells in patients with pulmonary tuberculosis

Zhang Qing,Xiao Heping,Su Bo
Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University,Tongji University School of Medicine,Shanghai200433,China

ObjectiveTo observe the clinical significance of CD4CDhigh25T cells from peripheral blood in pulmonary tuberculosis(PTB)patients.MethodsFrom January 2008 to February 2010,40 hospitalized PTB patients and 38 healthy controls from outpatient department for physical examination were enrolled.CD4,CD8 and CD4CDT cells which were presented by their percentages in peripheral blood lymphocytes of the above subjects were assessed by flow cytometry.ResultsThe frequencies of CD4CDT cells in PTB patients(1.9%±1.3%)were significantly higher than that in healthy controls(0.7%±1.0%)(t=5.237,P＜0.01).The frequencies of CD4T cells in PTB patients(47.9%±11.2%)were significantly lower than that in healthy controls(56.0%±14.6%)(t=2.830,P＜0.01).The frequencies of CD8T cells in PTB patients(26.2%±6.1%)were somewhat lower than that in healthy controls(33.0%±11.1%),but there was not statistical difference(t=0.353,P＞0.05).After 2 months of anti-TB treatment,the frequencies of CD4CDT cells in PTB patients(1.8%±0.8%)were decreased as compared with pre-treatment but without statistic significance(t=0.811,P＞0.05),while the frequencies of CD4T cells and CD8T cells in PTB patients(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%)were all increased as compared with pre-treatment but without statistic significance(t=1.496,0.570,respectively,all P＞0.05).ConclusionsCD4CDT cells are involved in cellular immune of PTB patients,inhibiting the activation and proliferation of CD4 and CD8T cells,affecting the clinical manifestations and prognosis of PTB.

tuberculosis,pulmonary/blood;T-lymphocytes;flow cytometry

Zhang Qing(zhqi709851@sohu.com)

张青(zhqi709851@sohu.com)

2010-07-11)

(本文编辑：张晓进)