LC-MS/MS法测定人血浆中甘草次酸及其临床药代动力学研究

张 军，陈 玟，居文政，刘 芳，邹 冲

(南京中医药大学附属医院临床药理科，江苏南京 210029)

甘草酸二铵(Diammonium glycyrrhizinate)是中药甘草有效成分提取物甘草酸的铵盐，有较强的抗炎、保护肝功能作用，作为治疗肝炎的有效药物广泛应用于临床。甘草酸在体内代谢为甘草次酸而发挥作用，这一转化依赖肠道正常菌群水解，且进行缓慢［1-2］。甘草次酸血浓度 HPLC［8］、LC-MS 测定方法已有文献报道［3-4，6］，但由于体内代谢物复杂，方法选择性差;文献［5］虽采用LC-MS/MS法测定甘草次酸血浓度，但其提取方法采用固相萃取，检测成本高，且检测方法的灵敏度不适合人体甘草酸治疗剂量的药代动力学研究。本研究采用LC-MS/MS方法测定甘草二酸铵胶囊口服给药人血浆中甘草次酸浓度，旨在建立简单、可靠、灵敏的甘草次酸分析测定方法，并用于甘草酸二铵口服给药的人体药代动力学研究。

1 材料与方法

1.1药品与试剂草酸二铵胶囊(江苏正大天晴药业股份有限公司生产，批号:080907，规格:50 mg/粒);甘草次酸对照品(由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号:110731-200615);泼尼松龙对照品(由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号:100153-199603);甲醇、乙腈、乙酸为色谱纯;乙酸铵为分析纯。

1.2仪器与液质条件API4000 LC/MS/MS联用仪(美国应用生物系统公司)，色谱工作站:Analyst 1.4.2;梅特勒-托利多AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司);Drict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)。

液相条件:色谱柱:Agilent ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm，5 μm);流动相 ∶甲醇 ∶乙腈∶醋酸铵缓冲液(5 mmol·L-1醋酸铵，0.2%冰醋酸)(15 ∶60 ∶25，V/V/V);流量:0.8 ml·min-1;柱温:40℃。

质谱条件:多反应监测(MRM);电喷雾离子化;离子极性:负离子;离子选择通道:甘草次酸，［MH］-，m/z 469.4/355.2;泼尼松龙，［M-H］-，m/z 358.9/279.9;离子源电压:4 000 V;离子源温度:500℃。

1.3受试者选择20名男性健康受试者，经体检合格，签署知情同意书，并经伦理委员会审批同意。实验前两周及实验期间未服用其它任何药物。

1.4试验设计受试者早晨空腹口服甘草酸二铵胶囊150 mg，用250 ml温开水送服;服药2 h后方可饮水，4 h后进统一标准餐。于服药前及服药后2、4、6、8、9、10、11、12、16、24、32、40、48、60 h 分别采血4 ml于肝素化试管中，分离出血浆，于-75℃保存待测。

1.5血浆样品的处理于试管中精密加入血浆样品0.5 ml、内标泼尼松龙溶液(0.0794 mg·L-1)30 μl，旋涡 10 s，加入 4 ml乙酸乙酯，旋涡振荡 3 min，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上层有机相 3.5 ml，40℃下空气吹干，加入80%甲醇100 μl溶液复溶，旋涡 2 min，12 000 r·min-1离心 5 min，吸取上清液进行 LC-MS/MS 分析，进样量5 μl。。

Fig 1 Representative MRM chromatograms of GA and IS in human plasma samples

1.6数据处理及统计分析将实验所得的血药浓度-时间数据采用DASver1.0软件中“临床药理”模块进行处理，计算各药代动力学参数。

2 结果

2.1特异性在本实验所采用的LC-MS/MS条件下，甘草次酸和内标互不干扰，峰形良好，无杂峰干扰，基线平稳，保留时间分别为3.65、0.83 min。

2.2介质效应考察取离心管数支，分别精密加入4.32，0.432，0.0864 mg·L-1的甘草次酸质控标准溶液20 μl，再分别加入内标溶液(0.0794 mg·L-1)30 μl，80% 甲醇溶液 50 μl旋涡 1 min，进样分析，记录峰面积A1。

另按“血浆样品的处理”项下操作提取空白血浆数管，挥干后同上操作，记录峰面积A2。

A2和A1的比值(A2/A1×100%)即为介质效应ME(%)。甘草次酸和内标介质效应分别在95.63% ～108.82%(n=3)和77.13%(n=9)。

2.3线性范围取玻璃试管数支，加入空白血浆0.5 ml，分别精密加入不同浓度的甘草次酸标准溶液20 μl，旋涡10 s混匀，配成含甘草次酸浓度分别为1.50，3.00，6.00，12.0，24.0，48.0，96.0，192 μg·L-1的含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作。计算甘草次酸峰面积As和内标峰面积Ai的比值f(f=As/Ai)，以峰面积比值f对血药浓度C作回归计算，得回归方程:f=0.15×C+0.00684，r=0.99965，权重系数w=1/C×C。药物浓度与峰面积间线性关系良好，线性范围为1.50～192.0 μg·L-1，最低定量限为 1.50 μg·L-1。

2.4精密度与准确度考察日内精密度与日间精密度(3 d)。按标准曲线配制方法制备含甘草次酸分别为 3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含药血浆质控样品，按“血浆样品的处理”项下操作，根据随行标准曲线求得实测浓度。实测浓度的RSD即为精密度，加入浓度和实测浓度的比值即为准确度，结果见Tab 1。

2.5提取回收率试验同上操作制备含甘草次酸分别为 3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含药血浆质控样品，按“血浆样品的处理”项下操作，记录峰面积A3。

提取回收率R% =A3/A2×4/3.5×100%，结果甘草次酸提取回收率在77.14%～83.64%(n=5)。

2.6稳定性试验甘草次酸和内标标准溶液室温放置4h，以甘草次酸峰面积和内标峰面积的比值计算，经与立即测定同浓度标准溶液进行比较，比值变化在95.68% ～103.75%之间;甘草次酸和内标标准储备液冷藏(5℃)放置60 d，以峰面积计算，经与当天新称量配制的标准溶液进行比较，甘草次酸和内标标准储备液峰面积分别为新配制的98.63%和97.53%(重量经校正)，结果表明甘草次酸和内标溶液室温放置4 h和冷藏(5℃)60 d稳定性良好。

Tab 1 Precision and accuracy of glycyrrhetic acid in human plasma

分别考察了含甘草次酸浓度分别为3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含药血浆质控样品在室温放置4 h以及经“血浆样品处理方法”后的分析物放置24 h、-75℃放置20 d及反复冻融3次条件的稳定性，经实测浓度与加入浓度进行比较，浓度变化在88.70%～115%，结果表明甘草次酸在上述条件下均稳定。

2.7人体内药代动力学研究20名健康受试者空腹口服甘草酸二铵胶囊150 mg后，血浆中甘草次酸平均浓度-时间曲线见Fig 2，其主要药代动力学参数见Tab 2。

Fig 2 Average plasma concentration-time curves after a single oral administration of Diammonium Glycyrrhizinate Capsule to 20 healthy volunteers

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of glycyrrhetic acid in 20 healthy volunteers with a single oral administration of Diammonium Glycyrrhizinate Capsule(x¯±s，n=20)

3 讨论

参照文献［3-4，6］建立的 LC-MS 甘草次酸检测方法应用于人体血浆检测中发现干扰较多，文献［4，6］中血浆的内源性成分和代谢产物干扰了甘草次酸的测定;实验考察了不同比例甲醇-水、乙腈-水及甲醇-乙腈-水作为流动相，发现本实验所建立的流动相能有效地将甘草次酸和内源性成分及代谢产物分离。文献［5］虽然建立了LC-MS/MS方法检测血浆中甘草酸及甘草次酸，但没有应用于临床甘草次酸血药浓度测定，其最低定量限10 μg·L-1不能满足甘草次酸常规血药浓度检测，且血浆样品处理采用了固相萃取，不适合于临床药代动力学大批量血浆样品检测。本研究建立的LC-MS/MS方法具有灵敏度高、干扰少、样品处理简单等特点可满足临床的药代动力学研究。

甘草酸二铵是甘草酸的铵盐，在体内迅速转化为甘草酸，甘草酸在体内再代谢为甘草次酸而显现药理活性，这一转化依赖肠道正常菌群水解，且进行缓慢［1，7］。肠内菌群在受到各种因素的影响后会出现一些变化，如个体胃肠道排空速度不同，胃肠道pH对药物的吸收，饮食结构突然改变，抗菌药物的使用，各种各样的疾病，特别是消化道疾病，气候变化，季节转换，精神状态不同等，尽管临床试验方案对诸如受试者的一般健康状况、饮食、用药等予以控制，但一些不定因素还是会导致肠内菌群存在个体差异，必然使个体对甘草酸的吸收、代谢和排泄存在差异。试验结果甘草次酸AUC、Cmax、Tmax变异系数达到了30%左右和药-时曲线的双峰现象正体现了甘草酸体内变化的复杂性。临床应用甘草酸二铵时，提示应视个体因素，包括疾病、饮食、合并用药特别是抗生素应用等情况加以分析，制定合理的给药方案。

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