禽呼肠孤病毒ZJS株种毒的纯净性鉴定

李慧姣，李俊平，杨承槐，李启红，张晓南，黄建华

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东新兴 527400)

病毒性关节炎/腱鞘炎是由呼肠孤病毒(Reovirus，REOV)引起的鸡特别是肉鸡的重要传染病［1］。病毒主要侵害鸡的关节滑膜、腱鞘和心肌，引起足部关节肿胀，腱鞘发炎，继而使腓肠腱断裂。病鸡表现为关节肿胀、发炎，行动不便，不愿走动或跛行，采食困难，生长停滞等。已从病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病及吸收不良综合征和骨质疏松症等病鸡的许多组织中分离到该病毒。REOV感染的鸡群常因跛行(病毒性关节炎/腱鞘炎)和包括增重减少、饲料利用率降低、死亡等总体生产性能低下，降低了鸡的经济价值，造成严重的经济损失。

为了开发用于雏鸡病毒性关节炎/腱鞘炎的活疫苗，在前期进行种毒传代和鉴定的基础上［2］，拟对引进的REOV ZJS株细胞毒(弱毒)按照现行《中国兽药典》［3］进行纯净性鉴定，以建立病毒性关节炎活疫苗的种子批供疫苗生产使用。

1 材料和方法

1.1 病毒 呼肠孤病毒 ZJS株(弱毒)C1～C3、C5、C8和C10代细胞毒，由中国兽医药品监察所制备、保存。

1.2 SPF鸡 7日龄，购自北京梅里亚维通公司。在本所SPF试验动物房正压隔离器内饲养供试验使用。

1.3 诊断用抗原及抗体

1.3.1 琼脂扩散(AGP)抗原和阳性血清 包括马立克氏病病毒(MDV)、鸡痘病毒(FPV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽腺病毒(FADV)、禽呼肠孤病毒(REOV)等AGP抗原和阳性血清，均由中国兽医药品监察所制备。

1.3.2 血凝抑制(HI)抗原及标准阳性血清 包括禽流感病毒(AIV)H5、H9亚型，新城疫病毒(NDV)和减蛋综合征病毒(EDSV)等HI抗原及标准阳性血清，均购自哈尔滨兽医研究所。

1.3.3 ELISA检测试剂盒 包括禽白血病病毒(ALV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、网状内皮组织增生症病毒(REV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(REOV)和鸡传染性贫血病毒(CAV)等ELISA检测试剂盒(每种试剂盒内含已包被好的酶标板、阳性血清对照、阴性血清对照、稀释液、酶标抗体、样品稀释液、底物、终止液和洗涤液)，均购自IDEXX公司。

1.3.4 阴性血清 SPF鸡血清，本所制备。

1.4 无菌检验 按现行《中国兽药典》规定方法进行检验。

1.5 支原体检验 按现行《中国兽药典》规定方法进行检验。

1.6 外源病毒检验 由于制备的REOV阳性血清不能完全中和10羽份(≥104.5TCID50)的种毒，故采用现行《中国兽药典》规定方法中的SPF鸡检验法进行。

1.6.1 接种方法 用7日龄SPF鸡20只，点眼、滴鼻接种10羽份(0.1 mL)，腿部肌肉注射100羽份(1 mL/只)，同时设一组10只非免疫对照组。观察21 d后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后42 d或第2次接种后21 d采血，分离血清。在42 d内，不应有疫苗引起的局部或全身症状和呼吸道症状或死亡。如果有死鸡，应进行病理学检查，以证明是否由REOV ZJS株种毒所致。

1.6.2 检查的外源病毒及其检验方法 对分离的血清用HI检验方法测定鸡新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合症病毒抗体;用ELISA方法测定鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮增生症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽呼肠孤病毒和禽脑脊髓炎病毒的抗体;用AGP方法进行鸡传染性法氏囊病病毒、禽呼肠孤病毒、鸡马立克氏病病毒、腺病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒的抗体检测。

1.6.3 结果判定

1.6.3.1 ELISA方法的判定 按照试剂盒说明进行。AEV、ALV、IBDV、IBV、REOV 样品的 S/P 值小于或等于0.2，判为阴性;样品的S/P值大于0.2，判为阳性［S/P值=(样品值－阴性对照值)/(阳性对照值－阴性对照值)］。REV样品的S/P值小于或等于0.5，判为阴性;样品的 S/P 值大于0.5，判为阳性。CAV样品的S/N值(样品值/阴性对照值)大于0.6，判为阴性;样品的S/N值小于或等于0.6，判为阳性。

1.6.3.2 AGP方法的判定 原倍血清出现沉淀线即判为阳性。

1.6.3.3 HI方法的判定 NDV、EDSV、AIV － H5亚型和H9亚型HI抗体≥1∶4，判为阳性。

1.7 特异性鉴定 将REOV ZJS株 C3、C8和C10代种毒用鸡马立克氏病疫苗稀释液(SPG)作10倍系列稀释，取10－3～10－7分别与等量原倍阳性血清混合，37℃左右中和1 h，接种已长成CEF单层细胞的96孔或48孔细胞板，每孔接种0.2 mL，每个滴度接种5孔，同时取10－5～10－8未经中和的病毒对照，接种细胞，每孔接种0.1 mL，37℃左右 CO2培养箱培养观察5 d，判定结果采用Reed－Muench法分别计算未中和的疫苗滴度与抗体中和后的疫苗滴度，用TCID50表示，两者的比值即为中和指数，中和指数应≥102。

2 结果

2.1 无菌检验 REOV ZJS株C1、C2和 C3代种毒无菌检验结果均为阴性，表明种毒未污染细菌和真菌。

2.2 支原体检验 REOV ZJS株 C1、C2和 C3代种毒支原体检验结果均为阴性，表明种毒未污染支原体。

2.3 外源病毒检验 REOV ZJS株C5、C8和 C10代种毒两次接种雏鸡后，42 d采血，进行血清抗体检测，种毒除产生禽呼肠孤病毒特异性抗体外，其他病原抗体检测均为阴性。在42 d内，种毒未引起局部或全身症状和呼吸道症状或死亡(表1)。

表1 REOV ZJS株种毒外源病毒检测方法与结果

2.4 特异性鉴定 REOV ZJS株C3、C8和C10代种毒经特异性阳性血清中和后，接种96孔板CEF中，培养 5 d，中和指数分别为 102.88、102.67和 103.0(≥102.0)。结果如表2所示。

表2 REOV ZJS株C种毒特异性鉴定

3 讨论与小结

保持病毒性活疫苗种毒的纯净性和特异性，对于保证产品的质量有着重要意义，种毒中污染外源病毒，则产品中必然会污染相应病毒，不但影响产品的质量，还能传播病毒，造成散毒和其他传染病的传播。国内有从禽用活疫苗中分离出网状内皮增生病病毒(REV)的报道［4］。崔治中等报道近年来我国鸡群免疫抑制性综合症越来越常见，并从江苏、山东某鸡场出现的典型病例中检测出REV和鸡贫血病毒(CAV)［5－6］，这些是否与使用污染了的疫苗有关尚待证实。国外也有报道使用REV污染的禽痘疫苗或MD活疫苗造成严重的经济损失［7－8］。澳大利亚最早报道接种火鸡疱疹病毒(HVT)后出现腺胃炎和网状内皮组织增生症，后来又报道蛋鸡群在接种被REV污染的MD疫苗后发生组织细胞性淋巴肉瘤［9］。本研究结果表明，呼肠孤病毒ZJS株种毒(细胞毒)未污染细菌、霉菌、支原体及外源病毒，纯净性和特异性各项鉴定结果均符合病毒活疫苗用生产毒种的相关规定［2］，可以作为病毒性关节炎活疫苗生产用种毒。

致谢:无菌检验和支原体检验项均由本所细菌制品检测室完成，在此，表示衷心的感谢!

［1］Saif Y M，Fadly A M，Glisson J R，et al.Diseases of Poultry［M］.12th ed.Ames:Blackwell Publishing，2008:310 －322.

［2］李慧姣，李启红，陆友龙，等.呼肠孤病毒弱毒S1133株特性研究［J］.中国兽药杂志，2003，37(9):15 －17.

［3］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部［M］.北京:中国农业出版社，2006.

［4］王景艳，李中明，赵 鹏，等，禽痘病毒活疫苗中网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其序列比较［J］.中国动物传染病学报，2010，18(1):35 －40.

［5］王 鑫，王 林，马诚太，等.PCR结合斑点杂交技术在检测网状内皮增生病毒中的应用［J］.中国兽药杂志，2010，44(8):5－9.

［6］崔治中，孟姗姗，姜世金，等.我国白羽肉用型鸡群中CAV、REV和REOV感染状况的血清学调查［J］.畜牧兽医学报，2006，37(2):152 －157.

［7］Fadly A M，Witter R L，Smith E J，et al.An Outbreak of Lymphomas in Commercial Broiler Chickens Vaccinated with a Fowlpox Vaccine Contaminated with Reticuloendotheliosis Virus［J］.Avian Pathol，1996，25:35 －47.

［8］Yuasa N，Yoshida I，Taniguchi T.Isolation of a Reticuloendotheliosis Virus from Chickens Inoculated with Marek’s Vaccine［J］.Natl Inst Anim Health Q，1976，16:141 －151.

［9］Jackson C A W，Dunn S E，Smith D I.Proventriculitis，“Nakanuke”and Reticuloendotheliosis in Chickens Following Vaccination with Herpesavirus of Turkeys(HVT)［J］.Aust Vet J，1977，53:457 －458.