薏苡仁注射液(康莱特)联合顺铂对人肺腺癌细胞A549抑制作用及机制

吕品田， 周 坤， 王亚珍， 刘 斌

(1.河北省人民医院肿瘤科，河北石家庄 050051;2.河北医科大学第二医院心内科，河北石家庄 050000)

肺腺癌是临床常见的恶性度较高的肿瘤之一，发现时已多处于进展期，很难依靠手术达到根治目的。化疗作为肺腺癌综合治疗的重要手段，在肺腺癌治疗中发挥重要作用，但肿瘤多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)的存在导致化疗效果并不理想。故寻找新型药物并逆转肿瘤的MDR表型对提高化疗效果、改善预后意义重大［1］。薏苡仁注射液(康莱特)以中药薏苡仁提取物为主要成分，近期用于临床肺腺癌治疗已取得明显效果，且该药与化疗药物联合应用具有抑制肿瘤的协同作用［2－3］，但关于该药具体调节肺腺癌MDR表型的机制报道很少。因此，本研究应用康莱特及肺腺癌常用化疗药物顺铂(CDDP)作用于人肺腺癌细胞A549，对其对肿瘤细胞的抑制情况及调节肿瘤MDR的作用机制进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞研究所，细胞置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中培养，2～3 d传代1次。正常细胞系人脑微血管内皮细胞HBMEC(Human brain microvascular endothelial cells)由本院科研中心保存。康莱特由浙江康莱特药物有限公司提供;注射用顺铂粉针(CDDP，齐鲁制药有限公司)，调整药物浓度为0.5μg/mL。将处于对数生长期的细胞经消化分散后计数，制成细胞悬液，各200μL/孔接种于96孔板内，分为康莱特组、CDDP组、康莱特+CDDP组及A549对照组，预培养24 h后，实验各组分别加入康莱特及CDDP各20μL。每组设6个复孔;并设空白对照(RPMI 1640培养液)和正常对照孔(生理盐水)，置于37°C，5%CO2培养箱培养48 h后进一步实验。

1.2 SRB显色法体外药物敏感性实验

培养结束后每孔加入预冷的50%的三氯醋酸(TCA)50μL，4℃放置1h以固定细胞，倒掉固定液，用超纯水洗5遍，干燥后每孔加入100 μL SRB液，室温避光放置10 min。弃去SRB，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥，结合的SRB用150 μL 10 mmol/L非缓冲Tris碱液(pH10.5)溶解，545 nm处测定每孔OD值。肿瘤细胞平均抑制率(IR)=(1－给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。

1.3 逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)法检测各MDR因子mRNA的表达

Trizol Reagent购自华美生物工程公司(Invitrogen公司产品)，一步法提取组织总RNA，以1.5%琼脂糖凝胶(含EB)电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度法测定RNA的纯度及含量。取2 μg RNA用于逆转录，20 μL 反应体系包括 Oligo(dT)0.1 μg，2 mmol/L dNTPs2.5 μL，Rnasin 0.1 μg 和 MMLV 200 U，反应条件42℃1 h，95℃5 min。每样本分别取1μL逆转录产物建立40 μL PCR反应体系。以GAPDH作为内参照基因。PCR反应参数如下:96℃预变性4 min;然后94℃ 变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环;最后72℃延伸反应5 min。各因子引物序列如下:MDR1(438bp):引物(F)5’－CGCCAATGATGCTGCTCAAG－3’，(R)5 ’－ ACCAAGTAGGCTCCAAACCG－3 ’;Bcl－2(373bp):引物 (F)5’－AGAGGGGCTACGAGTGGGAT－3’，(R)5’－TCAAAGAAGGCCACAATCCTCC－3’;Bax(353bp):引 物 (F)5 ’－TTGCTTCAGGGTTTCATCCAG－3’，(R)5’－AAGTCCAATGTCCAGCCCAT－3’。RT－PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带分析，各产物与GAPDH的比值作为表达水平的参数，进行PCR产物相对定量。

1.4 Western blot法检测增殖、凋亡因子蛋白的表达

P－gp、Bcl－2、Bax 一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗均为美国Santa Cruz公司产品。收取每组107个对数生长期的肿瘤细胞，分别加入细胞裂解液100 μL，冰浴 20 min，使细胞充分裂解。4℃，8 000 r/min离心10 min，收集上清，Bradford法测定蛋白浓度。每组取40μg蛋白样品，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭90 min，分别加入400倍稀释的一抗，4℃过夜。加入二抗，漂洗后暗室曝光，常规显影、定影。用BioRad图像分析系统分析，以蛋白条带的平均吸光度值(A值)表示蛋白表达的相对强度。

1.5 统计学处理

实验数据用SAS8.0统计分析软件分析。组间强度比值使用t检验，以P＜0.05为检验有统计学意义。

2 结果

2.1 康莱特联合CDDP对A549细胞的体外抑制作用

各组细胞中，与对照组比较，康莱特组、CDDP组、康莱特 +CDDP组 OD值明显降低(均P＜0.05)，以康莱特+CDDP组OD值降低最为明显(P＜0.01);康莱特对正常细胞系HBMEC则无明显抑制作用(P＞0.05)。见表1、图1。

表1 康莱特、顺铂对A549细胞和正常细胞的体外抑制作用

图1 各组细胞MDR1、Bcl-2、Bax mRNA表达水平

2.2 各组细胞 MDR1、Bcl－2、Bax mRNA 表达强度的比较

RT－PCR结果显示，与对照组比较，康莱特组、CDDP 组、康莱特 +CDDP 组 P－gp和 Bcl－2 mRNA 强度均较空白对照组降低(均P＜0.05)，而Bax mRNA强度则明显升高(P＜0.05);以康莱特+CDDP组变化最为显著(均P＜0.01)。而康莱特对正常细胞系HBMEC的4种因子mRNA则无明显影响(均P＞0.05)。见图1。

2.3 组细胞 P－gp、Bcl－2、Bax Western Blot检测结果的比较

Western Blot检测结果显示，与对照组比较，康莱特组、CDDP组、康莱特 +CDDP组 P－gp和 Bcl－2蛋白水平均较对照组降低(均P＜0.05)，而Bax蛋白水平则明显升高(P＜0.05);以康莱特+CDDP组变化最为显著。而康莱特对正常细胞系HBMEC的3种MDR因子蛋白水平则无明显影响(均P＞0.05)。见图2。

图2 Western blot法检测各组细胞MDR1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平

3 讨论

康莱特主要成分为薏苡仁提取物，具有益气养阴，消癖散结等功能，适用于气阴两虚，脾虚湿困型原发性非小细胞肺癌，该药单独应用或与化疗药物联合应用已在非小细胞肺癌包括肺腺癌的治疗方面取得了良好效果［2－3］。康莱特可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用［4－5］，但其与化疗药物联合应用时是否有化疗增敏效果及其与肺腺癌MDR关系的研究报道很少。本研究显示，康莱特对肺腺癌细胞A549有明显的抑制作用;该药作用于A549后肿瘤细胞的耐药相关因子MDR1/P－gp和凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)Bcl－2水平明显降低，而促凋亡蛋白Bax则水平升高，说明康莱特可通过调节上述因子水平逆转肿瘤MDR，达到抑制肿瘤的作用，但由于肿瘤MDR调控是多途径、网络式调节，康莱特具体参与了哪些途径还有待进一步深入研究。本结果还显示康莱特对于人正常细胞(人脑微血管内皮细胞HBMEC)无明显抑制作用，对该细胞的MDR因子水平也无显著影响，说明康莱特在用于肺腺癌治疗中有较强的选择性，对正常组织毒副作用较低，是较为理想的肺腺癌治疗用药。

肺腺癌由于起病隐匿，不易早期发现，患者就诊时多已处于进展期或晚期，手术难以达到彻底根治或已失去手术机会。故目前包括化疗在内的各种措施在该病的治疗中发挥着主要作用，而肺腺癌肿瘤细胞具有的MDR特性常导致化疗失败［6］，结合中药治疗以提高化疗效果、减轻毒副反应已成为当前临床研究的热点［7］。目前已有报道康莱特与化疗药物联合应用对肿瘤细胞杀伤有协同作用［3，8］，但具体机制尚无明确报道。故本研究对康莱特联合化疗药物CDDP对A549细胞系的作用情况进行了研究。结果显示，康莱特联合CDDP对A549的杀伤率较单独应用放疗更强，该作用是通过抑制DR1/P－gp的药泵作用和凋亡抑制蛋白Bcl－2的抗凋亡作用，同时促进Bax的促凋亡作用而实现的。这说明康莱特具有MDR逆转作用，与化疗药物联合使用可提高肿瘤细胞的化疗敏感性。

本研究初步证实康莱特可通过逆转肺腺癌细胞的MDR来增强化疗效果，与化疗具有协同作用。但本研究仅检测了部分MDR相关因子在用药前后水平的变化，对其中转导通路等具体机制尚未进行深入研究;体外细胞系研究也与临床研究存在较大差距。有待更深入研究其作用机制并应用体内实验予以验证，以期确定合适的康莱特与化疗联合作用方式，改善肺腺癌治疗的效果。

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