蓝萼甲素抗凝血作用研究*

2011-05-25 12:25马占强马世平
云南中医学院学报 2011年3期
关键词:血浆阿司匹林血小板

马占强,王 敏,张 健,傅 强△,马世平△

(1.中国药科大学中药学院,江苏 南京 211198;2.苏州大学药学院,江苏 苏州 215123)

蓝萼甲素 (glaucocalyxin A)是从唇科香茶菜属植物香茶菜 [Isodon japonica(Burrm F)Hara var glaucocalyx(Maxim)Hara]中提取分离出的一个二萜化合物[1]。蓝萼香茶菜为民间药,性味苦、寒,具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎等活性。现代药理研究表明,蓝萼香茶菜的乙醇提取液能减轻心肌缺血-再灌注损伤,保护心肌;蓝萼甲素可以通过抗血小板作用起到活血、心肌保护作用,如可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成血小板活化因子,能抑制花生四烯酸诱导的兔血小板血栓素A2生成,并同时升高前列腺素E2,能显著抑制ADP、AA和PAF等诱导的兔血小板聚集,显著升高血小板内cAMP水平,能增加机体对86Rb的吸收,而且有改善微循环作用[2-7]。但蓝萼甲素能否通过其他途径产生活血作用,罕见报道,本文采用体内和体外相结合的实验方法,对蓝萼甲素抗凝血作用进行了研究。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

蓝萼甲素 (纯度≥98%,HPLC)苏州利元医药科技有限公司提供,动物给药用0.5%CMCNa配制,体外实验用DMSO助溶,反应体系中DMSO终浓度为0.1%.阿司匹林肠溶片 (批号:H32026500),南京白敬宇制药有限责任公司,动物给药用0.5%CMC-Na配制。肝素 (150U/mg,批号:091123),南京图赛生物科技有限公司,用蒸馏水配制。凝血酶原时间 (PT)试剂盒 (编号:YZB/沪0556-40-2009)、活化部分凝血激酶时间 (APTT)试剂盒 (编号:YZB/沪0555-40-2009)和凝血酶时间 (TT)试剂盒 (编号:YZB/沪0558-40-2009),上海太阳生物制品有限公司。

1.2 动物

家兔,体重2.5kg,南京市江宁区青龙山动物繁殖中心提供,实验动物生产许可证:SCXK(苏)2007-0008;ICR小鼠,体重18~22g,扬州大学动物繁殖中心提供,实验动物生产许可证:SCXK(苏)2007-0001。

1996年至2013年,谢晖主政自治区劳教、监狱系统达17年之久。该两局虽是新疆自治区司法厅下属的二级局,但在人、财、物等方面长期独立于司法厅之外,致使在谢晖任职期间被打造成了“独立王国”。在担任监狱管理局党委书记、局长近三年时间里,谢晖更是疯狂以权谋私,造成十分恶劣影响。

1.3 仪器

HH-4数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司),纯水机 (Hi-tech Instruments Co.,Ltd),电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司),台式高速冷冻离心机 (Sigma,美国)。

2.3.1 小鼠凝血酶时间 (TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血激酶时间 (APTT)的测定

2 方法

2.1 小鼠凝血时间 (CT)的测定

取雄性ICR小鼠,选基础生理凝血时间在40~160s者用于实验,根据基础凝血时间随机分为5组,每组10只,空白组按0.1mL/10g灌胃生理盐水,其余各组均按等体积灌胃相应的药液,分别给蓝萼甲素低剂量4mg/kg、中剂量8mg/kg、高剂量16mg/kg和阿司匹林50mg/kg,每天给药1次,连续给药7d。小鼠于末次给药前禁食不禁水12h,末次给药后1h按毛细管法测小鼠凝血时间 (用长10cm、内径1mm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦后静脉丛中,深约4~5mm,轻轻转动,自血液注满开始计时,取出毛细管平放于桌上,每隔约15s折断一端约0.5cm,并缓慢向左右拉开,观察折断处出现凝血丝所需时间)。

2.2 小鼠尾尖出血时间的测定

雄性ICR小鼠50只,随机分为5组,每组10只,给药方法、剂量、周期及取血方法同2.3.1,血液与抗凝剂混匀后1000r/min离心10min,得富血小板血浆 (platelet rich plasma,PRP),置冰浴中备用。酶标板置37℃水面上,每孔加入混合血浆 100μL,温育1min,迅速加入37℃预温0.025mol/L氯化钙溶液100μL立即混匀,加氯化钙时开动秒表,每隔10s以钢丝轻轻向上挑动,至生成固体细丝即纤维蛋白终止计时,重复以上操作2次,自加钙至纤维蛋白形成的时间即为PRT[8]。

有的学校已经逐渐开放,由于学校的学术交流以及和社会各界交往的密切,使得他们对外的交流日益增多,大量的车辆也开始进入校园[2]。同时,很多教师也开始驾车上下班,造成校内的车辆大量增多。与之相对应的是,很多学校并没有针对车辆设置停车场,只能在教学楼等位置规划停车位,这使得很多停车位置并不科学,同时也依然难以满足当前校园停车位不足的问题。

2.3 小鼠凝血功能的测定

1.3.2抗性2015年、2016年国家区试稻瘟病综合指数平均分别为2.8和2.7,稻瘟损失率最高率5级,白叶枯病5级,中感稻瘟病,中感白叶枯病(引用国家区试数据)。根据怀宁县2年试种和示范表现,隆两优1377未发生稻瘟病和白叶枯病,其抗稻瘟、白叶枯病与对照丰两优四号相当。2017年、2018年不同程度发生稻曲病,比对照丰两优四号抗性差,表现中感稻曲病,应加强稻曲病防治。

雄性ICR小鼠50只,随机分为5组,每组10只,给药方法和剂量同2.1。动物每天给药1次,连续给药7d。小鼠末次给药前禁食不禁水12h,于末次给药1h后摘眼球取血,取血约0.9mL,加入装有0.1mL 3.8%枸橼酸钠抗凝剂的试管中,混匀,3000 r/m离心 15min,得贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP),置冰浴中备用。用凝固比浊法测定TT、PT和APTT。

两组年龄、性别、病程、基线期mMRC、CAT、CCQ分值比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见(表1)。

2.3.2 血浆复钙时间 (PRT)的测定

雄性ICR小鼠50只,随机分为5组,每组10只,给药方法和剂量同2.1。各组动物禁食12h,然后分别给药1次。于灌胃后57~59min,将小鼠置于固定器中,使其尾部垂直,至灌胃后第60min,在距尾尖3mm处剪断鼠尾,每隔30s用滤纸轻吸尾尖血液,直至吸不出血液,记录断尾至出血停止时间间隔,即为出血时间。

2.4 家兔体外凝血的测定

2.4.2 凝血酶原时间 (PT)和活化部分凝血激酶时间 (APTT)的测定

雄性家兔耳正中动脉取血3.6mL,迅速加入装有0.4mL 3.8%枸橼酸钠的离心管中,混匀,3000 r/min离心10min,得贫血小板血浆,置冰浴中备用。依试剂盒方法,酶标板置37℃水面上,每孔先加入待测血浆50μL,再分别加入蓝萼甲素低、中、高浓度溶液 (终浓度分别为 0.2、0.4和0.8mmol/L,用DMSO助溶)及肝素溶液 (终浓度为50U/mL)各50μL,混匀,温育1min,迅速加入37℃预温的凝血酶溶液100μL,立即混匀,加酶时开动秒表,4s后,每隔2s向上挑动,至生成固体细丝终止计时。重复以上操作3次,取平均值,即为凝血酶时间,另以等量终浓度为0.1%DMSO代替待测样品为对照。

2.4.1 家兔体外凝血酶时间 (TT)测定

对两组患者护理中发生不良事件的情况进行统计,采用院内自制的调差表,对高危药物外渗、患者身份识别错误、用药错误及患者坠床的发生率进行计算。

近年来,广西越来越重视健身休闲产业的发展,其产业规模也逐年扩大。2015年广西体育健身休闲活动总产出和增加值分别为7.5亿元和3.5亿元,占全区体育总产出和增加值的比重分别为4.8%和4.9%①资料来源:《广西壮族自治区体育局发布2015年全区体育产业规模及增加值的公告》(桂体经〔2017〕19号)。。综观整个体育服务业(除体育用品和相关产品制造业、体育场地设施建设外的其他9大类),经济规模较大的是体育场馆服务,总产出和增加值分别为21.2亿元和14.0亿元,占比分别为13.6%和19.5%。由此可见,传统体育产业的发展,体育场馆服务依旧是主要创收来源,健身休闲产业尚有较大提升空间。

血浆制备及加药处理同2.4.1,依试剂盒说明书的方法,测定凝血酶原时间和活化部分凝血激酶时间。

具体的做法以我公司需要开发的产品或教学资源为校企合作课题,让学校的骨干教师来参与合作开发软硬配套的新产品,这样可以达到培养教师和企业产品研发一箭双雕的目的。为此我们设计了校企合作课题研究“四控”方案,“四控”即控人数保质量、控内容保交流、控过程保流畅、控质量保成果。

2.4.3 血浆复钙时间 (PRT)的测定

取血及加抗凝剂方法同2.4.1,血液与抗凝剂混匀后1000r/min离心10min,得富血小板血浆,置冰浴中备用。酶标板置37℃水面上,每孔加入混合血浆50μL,分组及加药方法同2.4.1,加药后混匀,温育1min,迅速加入37℃预温0.025mol/L氯化钙溶液100μL立即混匀,加氯化钙时开动秒表,1min后每隔10s以钢丝轻轻向上挑动,至生成固体细丝即纤维蛋白终止计时,重复以上操作2次,自加钙至纤维蛋白形成的时间即为血浆复钙时间。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 对小鼠凝血时间 (CT)的影响

结果见表1,与正常对照组比较,蓝萼甲素剂量依赖性延长小鼠凝血时间,在剂量为4、8和16mg/kg时均有统计学意义。与正常对照组比较,阿司匹林50mg/kg显著延长小鼠凝血时间。

表1 蓝萼甲素对小鼠凝血时间 (CT)的影响(,n=10)

表1 蓝萼甲素对小鼠凝血时间 (CT)的影响(,n=10)

*P<0.05,与正常对照组比较

CT/s正常对照组别 剂量/(mg/kg)78.88±19.72阿司匹林 50 179.63±31.78*蓝萼甲素 4 116.00±35.04*蓝萼甲素 8 137.00±29.05*蓝萼甲素 16 149.88±20.95-*

3.2 对小鼠尾尖出血时间的影响

结果见表2,与正常对照组比较,蓝萼甲素剂量依赖性延长小鼠尾尖出血时间,在剂量为8、16mg/kg时具有统计学意义。与正常对照组相比较,阿司匹林50mg/kg显著延长小鼠尾尖出血时间。

表2 蓝萼甲素对小鼠尾尖出血时间的影响 (,n=10)

表2 蓝萼甲素对小鼠尾尖出血时间的影响 (,n=10)

*P<0.05,与正常对照组比较

/s正常对照组别 剂量/(mg/kg) 出血时间215.38±98.43阿司匹林 50 697.88±196.01*蓝萼甲素 4 315.22±141.19蓝萼甲素 8 416.25±189.69*蓝萼甲素 16 591.89±148.52-*

3.3 对小鼠凝血功能的影响

结果见表3,与正常对照组比较,蓝萼甲素剂量依赖性延长小鼠TT、APTT和PRT,在剂量为4、8、16mg/kg时,对TT、APTT和PRT的延长作用均有统计学意义。与正常对照组比较,蓝萼甲素剂量依赖性延长小鼠 PT,在剂量为8、16mg/kg时有统计学意义。与正常对照组相比较,阿司匹林50mg/kg显著延长小鼠TT、PT、APTT和PRT。

表3 蓝萼甲素对小鼠凝血功能的影响 (,n=10)

表3 蓝萼甲素对小鼠凝血功能的影响 (,n=10)

*P<0.05,与正常对照组比较

TT/s PT/s APTT/s PRT/s正常对照 - 18.15±0.89 14.15±0.56 31.41±2.70 67.29±8.组别 剂量/(mg/kg)40阿司匹林 50 21.50±1.26* 18.08±1.05* 38.69±2.39* 85.81±11.43*蓝萼甲素 4 19.64±1.24* 14.77±0.74 34.84±2.39* 76.04±6.03*蓝萼甲素 8 20.72±1.07* 15.12±0.88* 36.42±1.42* 81.65±4.37*蓝萼甲素 16 21.04±1.21* 16.77±0.94* 38.98±2.89* 83.97±8.89*

3.4 蓝萼甲素对家兔体外凝血的影响

结果见表4,与正常对照组比较,蓝萼甲素浓度依赖性延长家兔TT、APTT和PRT,在浓度为0.2、0.4、0.8mmol/L时,对TT的延长作用具有统计学意义,在浓度为0.4、0.8mmol/L时,对APTT和PRT的延长作用具有统计学意义。与正常对照组相比较,肝素50U/mL显著延长家兔TT、PT、APTT和PRT。

表4 蓝萼甲素对家兔体外凝血功能的影响 (,n=10)

表4 蓝萼甲素对家兔体外凝血功能的影响 (,n=10)

*P<0.05,与正常对照组比较

TT/s PT/s APTT/s PRT/s正常对照 - 18.02±1.28 15.27±0.76 31.58±3.17 69.38±8.组别 浓度/(mmol/L)03肝素 50U/mL 22.22±1.86* 18.21±0.97* 41.14±4.17* 85.89±10.82*蓝萼甲素 0.2 19.44±1.48* 15.28±1.07 34.33±3.56 75.15±8.62蓝萼甲素 0.4 20.55±1.53* 15.63±0.87 35.31±3.43* 82.07±8.36*蓝萼甲素 0.8 21.16±1.68* 15.91±0.87 38.71±3.42* 85.41±8.29*

4 讨论

人体内凝血系统和抗凝系统处于一个动态平衡的状态,过度凝血会导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病[9]。在血栓形成过程中,血小板活化与凝血系统激活具有重要作用,两者在体内紧密联系,凝血系统激活后产生的凝血酶,是一个强有力的血小板活化因子,血小板活化后又将促进凝血过程。抗血栓治疗主要针对凝血系统和血小板两个环节,分别称为抗凝治疗和抗血小板治疗。目前临床上常用的抗凝血药主要包括肝素类和香豆素类等,抗血小板药物最常用的是阿司匹林。肝素类药物通过促进抗凝血酶Ⅲ对含有丝氨酸残基的已经活化的凝血因子Ⅱa、ⅠXa、Xa、XⅠa、XⅡa的灭活,产生强大的抗凝血作用,但肝素类药物不能口服给药,不便于患者用药。香豆素类药物与维生素K结构相似,通过拮抗维生素K的利用,抑制凝血因子Ⅱ、VⅡ、ⅠX、X在体内的合成,产生抗凝血作用,香豆素类药物可以口服给药,但起效慢,且在体外没有抗凝血活血。阿司匹林可抑制环氧酶活性,抑制血小板花生四烯酸代谢产生血栓素A2,产生抗血小板活性。此外,阿司匹林还抑制凝血酶原在肝内的合成,具有抗凝血作用[10-11]。

血液凝固有内源性和外源性两条凝血途径,APTT和PT是临床凝血功能检测中最常用的两个参数,其中APTT主要用于检测机体的内源性凝血系统,其延长或缩短分别反映凝血因子Ⅱ、V、VⅢ、X、XⅠ和XⅡ的血浆活性降低或增加,PT则主要用于检测机体的外源性凝血系统,其延长或缩短分别反映凝血因子Ⅰ、Ⅱ、V、VⅡ和X的血浆活性降低或增加[12]。为探讨蓝萼甲素的抗凝血作用机制,本文研究了其对小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间的影响,并检测了其在体内和体外对TT,PT,APTT和PRT的影响,以确定其在体内和体外抗凝血作用的差异。研究结果显示,蓝萼甲素能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间,具有抗凝血活性。体内给药抗凝血实验结果表明,蓝萼甲素能显著延长小鼠APTT和PRT,提示其能通过干扰内源性凝血因子活性,使纤维蛋白的生成受到抑制,TT的显著延长,显示纤维蛋白原向纤维蛋白的转变受到了抑制。体内给药抗凝血实验结果还显示,蓝萼甲素也能显著延长PT时间,说明其对外源性凝血途径也有一定的抑制作用。蓝萼甲素的家兔体外抗凝血作用结果显示,蓝萼甲素能延长APTT、TT和PRT,但对PT无显著作用,表明蓝萼甲素在体外主要是通过抑制内源性凝血途径产生抗凝血作用的。

此前的文献报道,蓝萼甲素具有较强的抗血小板活性[2],本文的研究发现,蓝萼甲素还可以通过抗凝血机制参与香茶菜的活血效应,这与阿司匹林的作用特点相似。此外,蓝萼甲素在体内和体外均具有抗凝血活性,并且可以口服给药,这与临床上常用的肝素类和香豆素类抗凝药相比具有一定的优势,值得对其抗凝血的作用机制和临床应用做进一步深入研究。

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