3种ELISA试剂盒检测抗牛支原体抗体的比较

刘 洋，陈 维，宋志强，孙文静 ，李 媛，邹小辉，辛九庆*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

牛支原体(Mycoplasma bovis)属于支原体属，可引起犊牛的肺炎、乳腺炎、角膜炎和关节炎。M.bovis是柔膜体纲中继丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoidessubsp.mycoidesSC，MmmSC)对牛致病力最强的支原体[1-2]。该病原呈世界性分布[3]，2008年首次从我国某地区牛肺炎病例的牛肺中分离到M.bovis[3]。M.bovis引起的疾病与MmmSC引起的牛传染性胸膜肺炎(Contagious bovine pleuropneumonia，CBPP)具有相似的临床症状和病理剖检变化，不易鉴别诊断[4-6]。因此，迫切需求一种可靠的M.bovis血清学鉴别诊断方法。

国外商品化的检测M.bovis抗体ELISA诊断试剂盒有加拿大生产的检测M.bovis抗体ELISA诊断试剂(简称“Kit 1”)和比利时生产的试剂盒(简称“Kit 2”)。目前，尚未出现国产商品化的检测M.bovis抗体ELISA诊断试剂盒。因此，本实验室建立检测M.bovis抗体ELISA方法并组装成试剂盒(简称“HVRI试剂盒”)。本研究应用以上3种试剂盒对已知血清样品进行检测，统计检测结果与综合检测结果的符合率同时对3种试剂盒进行一致性分析，为HVRI试剂盒的应用提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 病原和血清 M.bovis湖北分离株由本实验室分离并鉴定，按照文献[3]方法培养至108CCU/mL(CCU为颜色变化单位)；采自不同地区自然感染发病牛血清样品19份，经血清学和病原学诊断为M.bovis感染；人工感染发病牛血清样品18份；牛传染性胸膜肺炎国际标准血清PS2(用于交叉反应)购自葡萄牙国家兽医实验室——世界动物卫生组织(OIE)指定的牛传染性胸膜肺炎国际参考实验室。所有血清样品进行牛传染性支气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒I型病毒(BPIV1)、牛副流感病毒Ⅲ型病毒(BPIV3)和口蹄疫病毒(FMDV)的血清学检测。对所有临床发病牛进行巴氏杆菌病原学检测，对人工感染和健康牛的鼻拭子做巴氏杆菌(PM)病原学检测。

1.2 主要实验材料 HVRI试剂盒由本实验室开发并研制；Kit 1由加拿大生产的检测M.bovis抗体ELISA诊断试剂盒购自北京兰博瑞生物技术有限公司；Kit 2由比利时生产的检测M.bovis抗体ELISA诊断试剂盒购自北京兰博瑞生物技术有限公司；HRP标记的抗牛IgG抗体和TMB显色底物购自Sigma公司。

1.3 血清样品的制备 断初乳的新生犊牛饲养至35 d～45 d，用Kit 1筛选M.bovis阴性犊牛18头，每头牛接种40 mLM.bovis纯培养物，参照文献[3]的方法监控零周起每周血清抗体和排毒的情况，选取转阳后的血清作为阳性血清样品。阴性血清样品38份，其中20份采自无M.bovis病史的健康牛群；另外18份阴性血清样品采自于用于人工感染前的18头牛。用Kit 1检测血清抗体，用PCR方法检测鼻拭子中有无M.bovis病原体。

1.4 间接ELISA试验 Kit 1和Kit 2按各自说明书所述方法进行。HVRI试剂盒操作顺序如下：以原核表达获得M.bovis抗原(另文发表)作为包被抗原，1∶160倍稀释的待检血清及阴性和阳性对照血清为一抗，37℃孵育，HRP酶标(1∶8000)为二抗，37℃孵育，TMB显色，H2SO4终止，通过OD450nm数值判定结果。

1.5 判定标准 Kit 1和Kit 2按照其附带说明书所述方法对结果进行判定。HVRI试剂盒判断标准为：以公式S/P=(S-N)/(P-N)计算各样品的S/P值(S为样品OD450nm值，N为阴性对照平均OD450nm值，P为阳性对照平均OD450nm值)。S/P≤0.351，判定为阴性；S/P>0.351，判定为阳性。

1.6 检测数据的处理分析

1.6.1 符合率试验 各试剂盒检测结果与综合检测结果的符合率按照公式进行：符合率=(试剂盒检测阳性样品为阳性的样品数+试剂盒检测阴性样品为阴性的样品数)/样品总数

1.6.2 一致性检验 Kappa统计量一致性强度按照文献[7]的方法进行，Kappa值愈高表示一致性愈好，当Kappa值<0时，表明两方法间一致性为极差；当Kappa值在0.0～0.2范围内，一致性为微弱；Kappa值在0.21～0.40范围内，一致性为弱；Kappa值在0.41～0.6范围内，一致性为中度；Kappa值在0.61～0.80范围内，一致性为高度；Kappa值在0.81～1.00范围内，一致性为极强。

2 结果

2.1 综合检测结果 自然感染发病牛均存在发热、咳嗽和消瘦等症状，剖检可见肺脏大面积实变并出现乳糜状结节等，血清学诊断与病原学检测结果诊断为M.bovis感染。18头人工感染牛在接种后2周～4周出现血清阳转(Kit 2检测)。鼻拭子监测结果显示，18头牛均在感染后2周～4周开始排毒。对所有血清样品进行 IBRV、BVDV、BPIV1、BPIV3和FMDV的血清学检测，结果均为阴性。对人工感染和健康牛的鼻拭子进行PM病原学检测，结果均为阴性。

2.2 与综合检测结果符合率的评价 经综合检测，19份自然感染发病样品和18份人工感染样品均为M.bovis阳性，共37份；18份人工感染前的牛血清样品和20份健康牛血清样品均为M.bovis阴性。Kit 1检测结果和HVRI试剂盒检测结果及综合诊断结果符合率分别为96.00%和92.00%，而Kit 2检测结果与综合诊断符合率仅为74.67%(表1)。Kit 2检测18份未食初乳的35 d～45 d健康犊牛样品，出现6份假阳性结果，其他两个试剂盒检测18份健康犊牛血清均呈阴性。

表1 3个试剂盒与综合诊断结果符合率分析Table 1 Analysis of the agreement rate of kits to Integrated diagnosis

2.3 检测试剂盒一致性 用Kappa值对3种试剂盒的检测结果进行一致性检验，HVRI试剂盒与Kit 1 Kappa值=0.812>0.8，有极强的一致性；Kit 1与Kit 2和HVRI试剂盒与Kit 2分别有中度的一致性(表2、表 3和表4)。

2.4 交叉反应 采用购自牛传染性胸膜肺炎国际标准血清PS2对3个ELISA试剂盒进行比较，结果表明，Kit 1和HVRI试剂盒检测判定为阴性，Kit 2检测判定为阳性。

表2 Kit 1与Kit 2一致性分析Table 2 Kappa consistency check of the Kit 1 and Kit 2

表3 Kit 1与HVRI试剂盒一致性分析Table 3 Kappa consistency check of the Kit 1 and HVRI Kit

表4 HVRI试剂盒与Kit 2一致性分析Table 4 Kappa consistency check of the HVRI Kit and Kit 2

3 讨论

本实验将临床症状、病理学变化、血清学和病原学诊断结果作为综合诊断依据，保证所选血清具有说服力。选取的37份阳性样品中19份来自于地方送检的自然感染发病牛，这些牛所在牛场在引入新牛后，肺炎病例开始出现或明显增多，抗生素治疗无效[9-10]。病理剖检发现，发病牛肺脏存在大面积实变，有M.bovis典型的乳糜状结节[11-12]。通过病原分离、PCR鉴定，证明为M.bovis阳性[3]；18份阳性样品由人工感染制得。剥夺初乳的犊牛经气管接种后，分别在攻毒后2周～4周阳转，经鼻拭子监测18头牛排毒，所以这18头牛诊断为M.bovis阳性；38份阴性样品中有20份来自于无M.bovis既往病史和临床症状小于4月龄的牛，有18份来自于未食初乳的35 d～42 d健康犊牛，经Kit 1检测，这38份血清全部为M.bovis阴性。

3种试剂盒检测样品结果表明，HVRI试剂盒和Kit 1的诊断结果与综合诊断结果符合率较高，分别为92.00%和96.00%，但Kit 2的符合率仅为74.67%，并且存在一定的假阳性率。采用在医学评价诊断方法方面应用广泛的Kappa一致性检验[7-8]，对这3种试剂盒一致性进行比较，结果表明HVRI试剂盒和Kit 1有极强的一致性，而Kit 2与其他两种试剂盒的检测结果一致性相对较差。用CBPP国际标准血清PS2对3个ELISA试剂盒的交叉反应评价，HVRI试剂盒和Kit 1均能排除MmmSC抗体的干扰，而用Kit 2检测结果证明Kit 2不能排除Mmm-SC抗体的干扰。通过上述比较发现，HVRI试剂盒的准确性接近于Kit 1而且二者有极高的一致性，二者能够作为开展M.bovis流行病学调查和隔离检疫的有效检测方法。HVRI试剂盒可以填补国产检测M.bovis抗体ELISA诊断试剂盒的空白。

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