H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

陈晓妹，王 飞，张 翼，刘丽玲，田国斌，曾显营，管雪婷，程 成，陈化兰，李雁冰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征[1]，AI病毒(AIV)亚型众多，其中H9N2亚型AIV在我国家禽中广泛存在[2]，虽然该亚型病毒致病力低，但临床上常与大肠杆菌和支原体等混合感染，影响家禽的产蛋率，同时给养禽业造成一定的经济损失。相关文献显示H9N2亚型AIV能够感染人类，使得H9N2亚型AIV具有比较重要的公共卫生学意义[3-6]。

诊断和疫苗接种是AI防制的关键[7]。血凝-血凝抑制(HA-HI)试验是AI诊断的常用方法，也是病毒抗原性差异分析的常用方法[8]，而病毒抗原性差异分析是筛选疫苗株的常用方法。特异性血清是HA-HI试验的必备条件。本实验从1996年～2008年我国流行的不同亚群的H9N2亚型AIV中筛选6株代表病毒株，将其血凝素(HA)基因经密码子优化后，分别克隆到pCAGGS载体中[9-10]，以重组质粒免疫SPF鸡，制备特异性的抗血清，为临床诊断和病毒抗原性差异分析提供特异性H9亚型AIV HA单因子血清。

1 材料和方法

1.1 病毒株、质粒和血清 6株代表病毒株分别为：CK/HuN/33/08(HuN33/08)、CK/HuNHS/1/06(HuNHS1/06)、DK/GX/10/05(GX10/05)、SH10/01(DQ064378.1)、HLJ135/00(DQ064366.1)和 SD6/96(DQ064376.1)，HA序列由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室测序保存；将H9亚型AIV的HA基因用鸡偏嗜的密码子进行优化，优化的序列由南京金斯特公司人工合成；真核表达质粒pCAGGS由农业部动物流感重点开放实验室保存；针对H9亚型AIV的HI阳性血清及293 T细胞由本实验室保存；JM109菌株感受态购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；FITC标记的兔抗鸡荧光抗体购自KPL公司；Lipofectamine2000TM试剂盒购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；DMEM和胎牛血清购自GIBCO公司。

1.3 真核表达重组质粒的构建及大量制备 将合成序列和pCAGGS以EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，用连接酶将两者相连。重组质粒以EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定。在JM109中扩增重组质粒，SDS-碱裂解法抽提重组质粒，并以聚乙二醇法纯化。

1.4 真核表达重组质粒瞬时表达检测 将重组质粒转染293T细胞内，48 h后进行间接免疫荧光检测。间接免疫荧光试验的一抗为H9亚型AIV的HI阳性血清，二抗为FITC标记的兔抗鸡荧光抗体，同时分别设置一抗为阴性血清的阴性对照和转染pCAGGS的293T细胞阴性对照。荧光显微镜下观察试验结果。

1.5 H9亚型AIV抗血清的制备 将24只1月龄SPF鸡分为6组，每组4只。每只腿肌注射200 μg(1 μg/μL)重组质粒。

免疫后每周采血，HI试验检测抗体效价，待效价达到峰值时心脏采血收获血清。

1.6 敏感性试验 将收获的血清与同源抗原、H9亚型AIV标准血清和抗原进行交叉HA-HI试验，检测其灵敏度。

1.7 特异性试验 将收获血清及H9亚型AIV标准血清与H1～H16亚型AIV抗原、新城疫病毒(NDV)抗原交叉进行HA-HI试验，检测血清特异性。

2 结果

2.1 真核表达重组质粒的构建及其酶切分析 重组质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切获得1700 bp和4700 bp两个片段，1700 bp片段与HA基因长度相符。测序结果表明HA基因正确插入pCAGGS载体(图1)。

图1 真核表达重组质粒pCAGG-HA的酶切鉴定Fig.1 Identification of pCAGG-HA by restrictive enzyme digestion

2.2 真核表达重组质粒瞬时表达检测结果 重组质粒转染293T细胞后，经过间接免疫荧光染色，表达的HA蛋白产物主要分布于细胞膜上，并在荧光显微镜下呈现出特殊的荧光。构建的6种重组质粒转染293T细胞均可见特异的荧光表达产物，6种重组质粒均能表达，一抗为阴性血清的阴性对照及转染pCAGGS的293T细胞阴性对照均为阴性(图2)。

图2 重组质粒转染293T细胞后的间接免疫荧光结果Fig.2 Indirect immunofluorescence assay of 293T cells transfected with recombinant plasmid

2.3 H9亚型AIV抗血清敏感性试验结果 SPF鸡免疫后第6周，抗体水平达到峰值，心脏采血收获血清。敏感性试验结果显示，除GX10/05及SH10/01血清，其他各血清对其HA同源的抗原HI效价均为最高。GX10/05血清对HuNHS1/06抗原HI效价最高；SH10/01血清对SD6/96抗原HI效价最高；HLJ135/00血清对SH10/01及GX10/05抗原没有HI作用；SH10/01血清对HLJ135/00抗原也没有HI作用；H9亚型AIV标准血清对HLJ135/00抗原HI效价低，对其他抗原HI效价均较高。HLJ135/00血清对H9亚型AIV标准抗原无HI作用(表1)。

表1 血清与H9亚型AIV抗原血凝抑制试验结果Table 1 The HI test of the antiserum with antigen of H9 subtype AIV

2.4 特异性试验结果 特异性试验结果显示，单因子血清对H1-H16亚型AIV抗原及NDV抗原无HI作用；H9亚型AIV标准血清对H7亚型AIV抗原HI效价为 2 log2；HLJ135/00、HuN33/08、HuNHS1/06、SH10/01、GX10/05和SD6/96单因子血清对H9亚型AIV标准抗原的HI效价分别为0 log2、7 log2、8 log2、8 log2、8 log2和8 log2。H9亚型AIV标准血清对H9亚型AIV标准抗原的HI效价为11 log2。

3 讨论

本实验选取1996年～2008年间分离自H9N2亚型AIV不同亚群的6株代表病毒株，将其HA基因经过密码子优化后，构建表达HA基因的真核表达质粒，将重组质粒免疫鸡，制备只含有HA抗体的单因子血清。

实验结果显示，除SH10/01以外的单因子血清对其同源抗原的HI效价均高于或等于标准血清，表明H9亚型AIV单因子血清的敏感性高于标准血清；H9亚型AIV单因子血清与其他亚型AIV抗原及NDV抗原无交互，而标准血清与H7亚型AIV抗原有交互，表明H9亚型AIV单因子血清的特异性强于标准血清。由于H9亚型AIV标准血清由H9N2亚型灭活全病毒制备，血清中含有病毒的多种蛋白抗体，其中神经氨酸酶(NA)抗体的空间位阻效应会产生非特异的HI作用[11]，因此产生交互现象。本实验中使用的病毒株，根据其HA基因型分类，CK/SH/10/01(H9N2)、DK/GX/10/05(H9N2)和 CK/SD/6/96(H9N2)均为BJ/1/94类病毒，抗原差异很小，因此制备的单因子血清抗体滴度相近；而HLJ135/00为TY/WI/66类病毒，与其他病毒抗原差异大，制备的单因子血清对其他抗原的抗体滴度低[12]。实验中测试抗原相同时，单因子血清的抗体滴度低于标准血清，由于单因子血清是由重组质粒单次免疫后制备的，而标准血清是由灭活全病毒多次免疫后制备的，导致单因子血清抗体滴度低于标准血清。

制备单因子血清用真核表达重组质粒免疫鸡，不用接触和处理活病毒，安全性更高。单因子血清中只含有HA的抗体，避免了NA抗体产生的空间位阻效应对HI试验结果的影响。本实验构建了6株H9N2亚型AIV的HA基因的真核表达重组质粒，并用重组质粒免疫SPF鸡制备了单因子血清。该血清与全病毒血清相比敏感性好、特异性强、可用于临床诊断及实验研究。

[1]陈化兰，于康震，田国斌，等.禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性[J].中国兽医学报，1997，17(6)：555-558.

[2]唐秀英，付朝阳，冯菊艳，等.H9亚型禽流感的流行与防制[J].预防兽医学进展，2000，2(4)：1-4.

[3]Butt K M,Smith G J,Chen Hong-lin,et al.Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in HongKong in 2003[J].Clin Microbiol,2005,43:5760-5767.

[4]郭元吉，李建国，程小雯，等.禽H9N2亚型流感病毒能感染人的发现[J].中华实验和临床病毒学杂志，1999，13(2)：105-108.

[5]Peiris M,Yuen K Y,Leung C W,et al.Human infection with influenza H9N2[J].Lancet,1999,35(4):916-917.

[6]Liu Jin-hua,Katsunori O.Genetic conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in mainland China[J].Virus Genes,2004,29(3):329-334.

[7]张丹俊.禽流感研究的新变化与防控[J].安徽农业科学，2006，34(22)：5874-5876.

[8]Lee C W,Senne D A,Suarez D L.Generation of reassortant influenza vaccines by reverse genetics that allows utilization of a DIVA(differentiating infected from vaccinated animals)strategy for the control of avian influenza[J].Vaccine,2004,22:3175-3181.

[9]姜永萍，李呈军，张洪波，等.含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒(AIV)HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究[J].中国预防兽医学报，2005，27(6)：441-444.

[10]左青山，姜永萍，冉多良，等.禽流感HA7基因DNA疫苗的构建及免疫保护效果研究[J].新疆农业大学学报，2007，30(4)：34-37.

[11]Lee C W,Senne D A,Suarez D L.Development and application of reference antisera against 15 hemagglutinin subtypes of influenza virus by DNA vaccination of chickens[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(3):395-402.

[12]Li Cheng-jun,Yu Kang-zhen,Tian Guo-bin,et al.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic coultry in mainland China[J].Virology,2005,340:70-83.