RP-HPLC法测定氨茶碱血清浓度

黄丹，路晓钦，董志（1.重庆医科大学药学院，重庆市 400016；重庆市第九人民医院，重庆市 400700）

氨茶碱是茶碱与乙二胺的复合物，药理作用主要来自于茶碱，是临床上常用的平喘药之一[1]。茶碱安全范围较小，个体差异性大，药物的相互作用和给药时间都能影响其体内过程，有效浓度与中毒浓度接近。据文献报道，目前公认血清茶碱治疗浓度在10～20μg·mL－1较理想；5μg·mL－1以上有效；＞20μg·mL－1则易出现心动过速、心律失常等不良反应[2]；＞35μg·mL－1可发生发热、失水、惊厥等症状，严重的甚至引起呼吸、心跳停止致死[1]。所以临床上常需要监测其血药浓度，以确保患者用药安全。目前监测氨茶碱血药浓度常用方法有荧光偏振免疫分析法[3]，但该方法价格较昂贵，同时受抗体试剂盒等限制而无法即时对其血药浓度监测。本试验采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法进行测定，避免了以上限制，且操作简便、准确、灵敏、重复性好，可用于氨茶碱血药浓度的监测。

1 材料

1.1 仪器

1100型高效液相色谱仪（美国Aglient公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋仪（江苏国华仪器厂）；BF2000氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）

1.2 试药

茶碱标准品（中国生物制品检验所，含量:99.0%，批号:100121-199903）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为双重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:大连依利特BDS C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇-水（15∶85）；柱温:35 ℃；流速1mL·min－1；检测波长:275 nm；进样量:20μL。

2.2 溶液的配制

准确称取茶碱标准品9.5mg于10mL容量瓶中，用适量双重蒸馏水溶解，并稀释至刻度，配置成浓度为950μg·mL－1的贮备液，置于4℃冰箱备用。另将标准贮备液用甲醇分别稀释成浓度为42.5、21.25、10.625、5.625、1.105、0.5μg·mL－1的系列标准溶液，置于4℃冰箱备用。

2.3 血样处理

取空白人血清100μL，加入适量的茶碱标准溶液，并加入双重蒸馏水50μL涡旋混匀，再加入乙腈50μL沉淀蛋白，12000 r·min－1离心10min，吸取上清液，置60 ℃水浴中氮气吹干，残渣用双重蒸馏水100μL溶解，取20μL进样。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血清；B.茶碱标准溶液+空白血清；C.茶碱标准溶液；1.茶碱Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.theophylline standard substance+blank serum；C.theophylline standard substance；1.theophylline

2.4 标准曲线的绘制

空白血清中分别加入“2.2“项下系列标准溶液使其终质量浓度分别为42.5、21.25、10.625、5.625、0.5μg·mL－1，按照“2.3”项下方法处理，取20μL进样测定，记录色谱。以茶碱血药浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程为Y＝63.115X+12.669（r＝0.9999）。结果表明氨茶碱血药浓度在0.5～42.5μg·mL－1范围内线性关系良好，本方法最低检测浓度为0.5μg·mL－1（信噪比（S/N）≥3）。

2.5 回收率试验

取空白血清100μL，配制茶碱浓度分别为42.5、10.625、0.5μg·mL－1，每浓度样品各5份，按“2.3”项下方法操作测定，根据测定的茶碱峰面积，代入标准曲线计算得到茶碱的浓度，以测得值与实际值之比计算方法回收率[3]。另用“2.2”项下配置好的浓度为42.5、10.625、0.5μg·mL－1标准溶液进样，以血样和标准溶液测得值的峰面积之比计算提取回收率，见表1。

表1 回收率及精密度试验结果Tab 1 Results of recovery and precision tests

2.6 精密度试验

空白血清中分别加入不同浓度的标准溶液，使之浓度为42.5、10.625、0.5μg·mL－1，每种浓度做5份，按照“2.3”项下方法处理，取20μL进样。于同日内测定5次，并连续测定5 d，结果见表1。

3 讨论

目前，临床上常用于监测氨茶碱血药浓度的方法除高效液相色谱法外，还有紫外分光光度法[3]、荧光偏振免疫分析法[4]以及毛细管电泳法[5]。紫外分光光度法测定氨茶碱的血药浓度缺点在于干扰较大，灵敏度相对较低，提取过程较复杂；荧光偏振免疫分析法操作较简单，但价格昂贵，同时受仪器更新导致无法即时购买相应抗体试剂盒等限制；采用高效液相色谱法则可避免上述缺点。据文献报道[6]，用高氯酸沉淀蛋白干扰较小，但高氯酸酸性较强，不利于色谱柱的保护。本试验过程中，笔者尝试过用甲醇[7，8]沉淀蛋白，但干扰较大；而先用水提取茶碱，再用乙腈沉淀蛋白，氮气吹干后用水溶解可以消除脂溶性杂质干扰。流动相选择甲醇-水（15∶85）可以使峰形更尖锐，拖尾减少。茶碱属于碱性物质，使用BDS色谱柱更利于碱性物质的分离，加保护柱后，保留时间为6.9～7.56min，无杂质干扰。本试验操作过程简便，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，可以作为临床的茶碱血药浓度监测使用。

[1]黄敬耀主编.药理学[M].北京:人民卫生出版社，2006:284.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典·临床用药须知[S].2000年版.北京:化学工业出版社，2001:318.

[3]Liu HY，Pi XT，Zheng XL，et al.Pharmacokinetics of aminophylline delivered to the small intestine and colon using remote controlled capsules[J].Chin Med J（Engl），2010，123（3）:320.

[4]Yin C，Tang C，Wu X.HPLC determination of aminophylline，methoxyphenamine hydrochloride，noscapine and chlorphenamine maleate in compound dosage forms with an aqueous-organic mobile phase[J].J Pharm Biomed Anal，2003，33（1）:39.

[5]范国荣，林 梅，胡晋红，等.毛细管电泳法测定茶碱血浆浓度[J].药学进展，2000，24（3）:167.

[6]杨积平，裕海明.反相高效液相色谱法测定氨茶碱人体血药浓度[J].安徽医药，2006，10（4）:263.

[7]Ahn HW，Shin WG，Park KJ，et al.Pharmacokinetics of theophylline and caffeine after intravenous administration of aminophylline to premature neonates in Korea[J].Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1999，105（1）:105.

[8]Baskaran R，Shanmugam S，Nagayya-Sriraman S，et al.The effect of coenzyme Q10on the pharmacokinetic parameters of theophylline[J].Arch Pharm Res，2008，31（7）:938.