经颅磁刺激对海马原代神经元突起生长的影响

王彦永，马 琳，马晓伟，马芹颖，顾 平，王铭维

经颅磁刺激 (transcranial magnetic stimulation，TMS)技术为国内外研究的热点，TMS可在脑深部产生感应生物电流，从而影响相应脑神经元电活动和局部功能的一种无创的物理治疗方法。临床研究发现帕金森病 (Parkinson's disease，PD)患者经TMS治疗后其动作反应时间及运动灵活性均有显著改善［1］，统一帕金森病评分量表 (UPDRS)评定症状有明显的好转［2-3］。动物实验表明，TMS可促进脑缺血大鼠神经元增殖［4］。本研究观察了磁刺激作用后原代培养的神经元的突起及形态改变，初步探讨磁刺激影响神经元生长发育的可能机制，为临床上应用经颅磁刺激治疗神经系统疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和动物 B27添加剂、DMEM/F12(1∶1)、neurobasal培养液和DMEM为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、Hoechst33258、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、抗微管相关蛋白-2(microtubule associated protein 2，MAP-2)抗体和FITC标记的抗小鼠IgG抗体购于Sigma公司。成年和新生SD大鼠均购自河北医科大学实验动物中心。

1.2 海马神经元原代混合培养 取昆明新生小鼠，浸泡在750 ml/L乙醇中消毒后，放在一次性无菌滤纸上，剪下鼠脑，剥出完整的脑组织，放在预冷的解剖液中分离海马。将所取组织剪碎后用1.25 g/L胰酶，37℃消化10～15 min，用含10 ml/L胎牛血清的DMEM培养液终止消化。用火焰抛光的玻璃吸管反复吹打后静置，待组织块沉淀后吸取上清，反复5次后将收集的上清液以800 r/min离心5 min，弃上清后加入含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，接种到预先用多聚赖氨酸包被的35 mm小培养皿中。将细胞培养在含50 ml/L CO2的37℃恒温培养箱中。过夜后，将培养液更换为含20 ml/L B27的neurobasal无血清培养液，3 d后换液，培养6 d的细胞用于实验。

1.3 实验分组 实验分为4组:(1)正常组 (Contorl，C):在37℃CO2孵育箱中正常培养。 (2)假刺激组 (Shame，S):暴露于磁场环境，但不接受磁刺激。(3)40%最大刺激强度组 (40%of maximum intensity of stimulation，M1):利用40%的磁场最大刺激强度 (约0.76 T)作用于细胞。 (4)60%最大刺激强度组 (60%of maximum intensity of stimulation，M2):利用60%的磁场最大刺激强度 (约1.14 T)作用于细胞。

1.4 磁刺激干预 磁刺激干预开始于细胞种于培养皿24 h后，于每日同一时间刺激细胞。每日刺激3组，每组20序列，每个序列间隔1 s，每组间隔1 min，连续刺激5 d。刺激频率为1 Hz，刺激强度参照实验分组。每次对细胞实施磁刺激时磁头距细胞约1.0 cm。实验中应用的磁刺激仪为英国产的Magstim22型磁刺激仪，频率为1 Hz，最大输出强度为1.9 T，磁头直径9 cm。

1.5 细胞免疫荧光染色 培养的细胞首先用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)漂洗，用新鲜配置的40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，PBS洗涤后用10 ml/L的过氧化氢清除内源性过氧化物酶10 min;3 ml/L Triton作用20 min，室温下用山羊血清封闭20 min;加入map22抗体 (Neomarker，1∶200)4℃过夜;PBS洗涤后加入FITC标记的二抗 (1∶100)室温1 h，为明确神经元总数，Hoechst33258(10μg/ml)复染胞核;每步骤间均经0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。每次行免疫细胞化学染色时，均设1张阴性对照，即一抗由PBS代替，其余染色过程相同。最后置于Nikon倒置荧光显微镜(TE2000-U型)下观察，CCD(Nikon digital camera DXM-1200F)采样。每孔随机选择15个视野在200倍下对MAP-2阳性细胞进行计数，每一时间点均做3个复孔。使用倒置荧光显微镜 (Nikon TE2000)观察MAP-2阳性细胞形态。

1.6 细胞突起计数 在倒置荧光显微镜下每孔以“之”字形由上而下随机选择15个不同的视野，使最终计得的细胞总数不少于600个。使用ACT-1软件采样，应用Image Pro-Plus软件计数MAP-2阳性细胞的突起数及突起长度，细胞突起长度以待测细胞自身胞体最大直径为测量单位，并通过计数Hochest33258标记明确的MAP-2阳性细胞总数，然后计算不同突起个数的神经元及不同突起长度的神经元在总神经元中所占的比例。为保证采集图像的质量，每次实验均根据阴性对照结果调节曝光时间。各组实验独立重复3次，进行相同的计数过程，但由于海马神经元为大锥体神经元，培养6 d后突起生长较长且细胞与细胞联系较为密切，所以本实验结果中未统计海马原代神经元的突起长度。

1.7 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)

1.7.1 引物设计 根据Gene Bank的cDNA序列经Primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实验中涉及的引物如下:目的基因为编码SYN-I的基因，其上游引物序列为5'-TTCTTCGGA ATG GAG TCA AA-3'，下游引物序列为5'-TGC TTG TCT TCA TCC TGG TG-3'，扩增片段长度为711 bp;GAP-43的上游引物序列为5'-CGA GAA AGA TCC CAA GTC CA-3'，下游引物序列为5'-GAA CGG AAC ATT GCA CAC AC-3'，扩增片段长度为206 bp;β-actin的上游引物序列为5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'，下游引物序列为5'-TCCTCCCTG GAG AAG AGCTA-3'，扩增片段长度为301 bp。

1.7.2 总RNA的提取与测定 弃去培养基，采用TRizol试剂一步法提取总的RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，紫外投射仪观察，可见18 S和28 S两条RNA条带。取2μl RNA溶液用紫外分光光度计测定吸光度值 (OD值，OD260/OD280≥1.8)。总RNA 量 =OD260×40(ml/L) × 体积 (L)。校正各组总RNA浓度。

1.7.3 RT-PCR 取1μg总 RNA，加入4μl逆转录缓冲液(10×)，2μl dNTP混合液，1μl RNA酶抑制剂，1μl逆转录酶，MgCl24 μl，5 × RT-buffer 4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L RNasin 0.25 μl，M-MLV 0.75 μl，OligvdT 1 μl引物，再加DEPC水补足到20μl，42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min，得到的cDNA置于-20℃保存备用。PCR反应体系(50μl):逆转录缓冲液 (10×)5μl，dNTP 1μl，MgCl25 μl，上游引物P1 5μl，下游引物P2 5μl，DNA聚合酶1 U，反转录产物1μl，加去DEPC水至50μl。将上述各组分混合均匀，按照如下反应条件进行PCR扩增:预变性94℃2 min，变性94℃ 30 s，退火55℃ 40 s，延伸72℃ 1 min，经过35个循环后72℃ 15 min。PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 TMS对海马原代神经元突起形态的影响 实验中连续观察发现:TMS 24 h与48 h时可见细胞均匀分布在培养皿上，小部分细胞可见短小突起，各组之间无明显差别。TMS 72 h后观察见细胞生长状态良好，与C组和S组比较，M1、M2组细胞突起较长，细胞与细胞间联系较多，部分细胞表现为多突起生长。TMS 5 d后观察细胞与细胞间网状连接更加明显，镜下已不能明确观察各组间差别 (见图1)。

2.2 各组海马原代神经元突起数计数 TMS 5 d后计数，含有2个突起的神经元占总神经元的比例4组间比较，差异有统计学意义 (F=0.008，p＜0.05)，M1组、M2组含有2个突起的神经元占总神经元的比例较C组和S组明显增多;含有3个及3个以上突起的神经元占总神经元的比例4组间比较，差异有统计学意义 (F=0.011，p＜0.05)，M1组、M2组含有3个及3个以上突起的神经元占总神经元的比例较C组和S组明显增多 (p＜0.05，见表1)。

2.3 TMS对海马原代神经元SYN-I mRNA表达的影响 M2组的SYN-I mRNA表达与C、S两组比较差异有统计学意义(p＜0.05);而M1组SYN-I mRNA表达虽然与各组间表达有一定的不同，但差异无统计学意义 (P＞0.05，见图2)。

图1 各组海马神经经元突起生长的观察 (200×)Figure 1 The growth state of hippocampus neurons in each group(C:control group;S:shame group;M1:M1 group;M2:M2 group)

表1 经颅磁刺激对原代培养海马神经元突起生长的影响(x—±s，%)Table 1 The effect of hippocampus neurons percentage after 5 days by transcranial magnetic stimulation

图2 TMS对海马原代神经元SYN-I mRNA表达的影响Figure 2 SYN-ⅠmRNA expression in the hippocampus(C:controlgroup，S:shame group，M1:M1 group，M2:M2 group)

3 讨论

TMS是在强大电磁场作用下，在脑深部产生感应生物电流，从而影响相应脑神经元电活动和局部功能的一种无痛、无损伤、操作简便、安全可靠的生物学技术，由Barker等［5］在1985年首先创立。在20多年的发展中，TMS的临床应用研究一直集中在治疗精神心理疾病和神经退行性疾病［6］。通过调节频率、强度、刺激间歇和刺激时间对中枢神经系统的功能产生不同的影响，因而对中枢及外周神经系统疾病具有治疗作用［7］。那么，TMS对于神经元的发育突起生长、突触的建立与稳定是否具有促进作用?本实验室前期研究利用频率为1 Hz的低频磁刺激干预对数生长期的PC12细胞，发现磁刺激作用后PC12细胞突起生长明显增多以及多巴胺 (DA)分泌增加［8］;动物实验还发现TMS作用于MPTP诱导的PD小鼠能够增加纹状体GAP-43和Syp表达［9］，提示TMS有促进神经再生和突触重塑作用。那么，TMS对于体外培养的原代神经元是否具有相同的作用?

本实验以强度为0.76 T和1.14 T、频率为1 Hz的磁场作用于原代培养的海马神经元，利用免疫荧光化学染色方法观察神经元突起生长情况。TMS作用后观察发现M1、M2组的神经元突起数目均较C、S组明显增多，说明该参数下的磁刺激有促进海马原代神经元突起生长的作用。我们设想TMS对突触的形成及稳定有无促进作用。突触蛋白 (Synapsin，SYN)作为轴突终末端的突触前囊泡膜上的特异性的钙结合糖蛋白，是一种重要的囊泡膜标志蛋白［10］，它通过磷酸化控制神经末梢释放突触囊泡的数量、参与神经递质的释放及突触囊泡的循环，在神经元的发育中起重要作用［11］。目前研究较多的SYN-I是1972年Johnson等发现的突触蛋白家族的第一个成员。SYN的主要功能为:(1)参与神经递质的释放及突触囊泡的循环［12］;(2)对突触的发育有重要作用［13］;(3)参与调节神经轴突的延伸［14］。本实验中利用RT-PCR检测原代神经元SYN-I mRNA表达发现，在海马原代神经元M2组的SYN-I mRNA表达明显多于其他各组;而M1组的SYN-I mRNA表达虽然比C、S组多，但在统计学上无明显差异;结合免疫荧光化学染色对细胞的观察分析:(1)本实验中的两种磁场强度在一定程度上都可以促进海马及中脑原代神经元的突起生长，并且这种促生长作用与磁场强度有一定的关系。有研究表明TMS可促进脑卒中后梗死周边区GAP43和SYN的表达［4］，这都提示TMS有促进神经再生及促进突触再建和增强、完善再建突触效能的作用。(2)在本实验中仅M2组SYN-I表达较其他组有意义，M1组SYN-I较未接受磁刺激组无明显改变，而细胞突起的形态学上有所改变，所以考虑可能为实验中M1组磁场强度尚不足引起SYN-I mRNA表达的变化以及其他因素同样参与了调节神经元突起的生长。Kim等［15］观察了恒磁场对神经元培养的影响及在磁场作用下对新生的轴突方向性的影响，发现磁场作用5 d后的细胞突起较未刺激组细长且笔直，并且突起生长方向为垂直磁场方向，但未发现细胞骨架蛋白及突触蛋白表达水平的改变。因此，磁刺激作用于细胞所产生的一系列效应并不是单一因素所引起，它所产生的效应与刺激参数和被刺激细胞功能状态有关;SYN在MS作用后的神经元突触延伸过程中的不同阶段发挥着一定的作用。这种作用的确切机制尚需在以后的研究中进行深入的探讨。

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