槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞凋亡及热激蛋白表达的影响

张晓琳，张明洁，许 静，杨 卓

(南开大学医学院临床医学系神经生理学实验室，天津 300071)

槲皮素(quercetin)及其衍生物为一类天然黄酮类化合物，是人类饮食中最主要的生物类黄酮，具有广泛的药理作用［1－2］。近年研究发现，槲皮素具有显著的抗肿瘤作用，其对体外培养的多种癌细胞如HL-60，HELE，HepG2，HeLa 等具有抑制增殖及诱导凋亡 的 作 用［3－5］。热 激 蛋 白 (heat shock protein，HSP)是一组高度保守的蛋白质，作为细胞受损的标志、神经保护因子，其对神经细胞的损伤有保护作用。目前研究证实，机体受到各种刺激，如高温、缺氧、氧化应激、感染、创伤和代谢毒物等作用时，细胞诱导产生HSP70，增强细胞对损害的耐受力，维持细胞正常功能，提高生存率。因此，本研究通过检测槲皮素对热应激后神经胶质瘤C6细胞凋亡及HSP70表达水平的影响，进一步探讨槲皮素抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器

槲皮素，二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)及凝胶电泳所用试剂均购自美国Sigma公司。DMEM培养基(美国，Gibco公司);胎牛血清(中国，兰州民海生物工程有限公司);青霉素和链霉素(中国，哈药集团);胰蛋白酶(美国，Amerseco公司);Parafilm膜(美国，Parafilm公司);双金鸡钠酸、蛋白定量试剂盒(中国，南京建成公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和ECL发光试剂盒(美国，Millipore公司);二甲亚砜(DMSO，中国，上海生工公司);annexinⅤ-FITC凋亡试剂盒(中国，凯基生物);β肌动蛋白小鼠单克隆抗体、HSP70小鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(美国，Santa Cruz公司)。

倒置相差显微镜(日本，Olympus公司)，酶标仪(美国，BIO-TEK公司)，日本产奥林巴斯显微镜。流式细胞仪(美国，BD公司)。低温离心机(德国，Hettich公司)。

1.2 细胞株

C6细胞株来源于美国标准菌种收藏所(ATCC)，购自中国医学科学院上海细胞生物学研究所。C6细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1、链霉素 100 kU·L－1的 DMEM 培养基中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.3 MTT法检测细胞存活率

C6细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基稀释至1×108L－1，将细胞接种至96孔培养板，每孔加入细胞悬液200 μl(空白孔不加细胞，只加培养基，用于酶标仪测定时调零)，在37℃和5%CO2的条件下贴壁培养24 h。观察细胞的生长情况，至细胞长满80%左右，换成无血清DMEM培养基后再培养24 h，使细胞同步化;然后分别加入含槲皮素0，50，100，150 和 200 μmol·L－1的无血清培养基，每个剂量重复6孔，每组重复3次。以上体系置培养箱中孵育1 h后培养板周边用Parafilm膜密封，于42℃水浴中加热1 h，然后在37℃，5%CO2培养箱中培养12 h。按以上方法处理细胞后，吸弃培养基后换入新培养基，每孔 180 μl。每孔加入 20 μl浓度为 MTT 20 mg·L－1(终浓度为 5 mg·L－1)，置 CO2培养箱中孵育4 h，吸弃培养基，每孔加入150 μl DMSO终止反应，混悬15 min，以空白孔调零，在吸收波长为490 nm条件下，用酶标仪测定各孔的吸光度值(A)。细胞存活率(%)=药物处理组A490nm值/加热对照A490nm值×100%。

1.4 Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡

大约 5×109L－1的细胞于 37℃ 中与 Hoechst33342(10 μg·ml－1)孵育 15 min 后，离心、用PBS漂洗1次，重悬为密度大约2.5×1010L－1。上机检测前加入1 ml PI 25 mg·L－1。荧光显微镜(激发滤色镜波长:330～380 nm;吸收滤色镜波长:420 nm)观察细胞。每处理组至少计数200个细胞，实验重复3次。

1.5 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡百分率

C6细胞以每孔1×105密度接种于6孔板，分别加入槲皮素0，50，100 和200 μmol·L－1，培养箱中孵育1 h。然后培养板周边用Parafilm膜密封，于42℃水浴加热1 h，然后37℃，5%CO2的培养箱中培养12 h。除去培养液，4℃预冷的PBS液洗2次，加胰酶消化，收集细胞于15 ml离心管中，831×g离心后弃去上清液，以PBS清洗沉淀1次，再重复离心、清洗1次。最后用500 μl结合缓冲液重新悬浮细胞，避光加入 5 μl annexinⅤ-FITC、5 μl PI，混匀后室温避光孵育15 min，进行流式细胞术分析。

1.6 Western印迹法检测HSP70表达

细胞以每孔1×105密度接种于6孔培养板，并随机分为3组:正常对照组，正常培养细胞;加热组，以Parafilm膜密封6孔板，42℃加热1 h后在培养箱中恢复培养12 h;槲皮素处理组，用含槲皮素200 μmol·L－1的培养基在培养箱中孵育 1 h，随后处理同加热组。按照分组条件处理结束后，用预冷PBS缓冲液洗3次，并在每孔中加入50μl细胞裂解液(PMSF 10 mmol·L－1;Tris·HCl 1 mol·L－1，pH 8.0;NaCl 0.15 mol·L－1;1%Triton X-100;5%Cooktail)。分别收集3组细胞于1.5 ml Eppendorf离心管中，在冰上充分裂解至少30 min后，在低温离心机中以4℃，831×g离心10 min。取上清液于新的Eppendorf离心管中，用双金鸡钠酸法进行蛋白定量后，加入5 × 上样缓冲液(Tris·HCl 0.5 mol·L－1，pH 6.8;50%甘油，DTT 78 g·L－1，SDS 100 g·L－1，溴酚蓝5 g·L－1)。煮沸后，分装后存于－70℃冰箱备用。

样本(每个泳道上样20 μl，含总蛋白15 μg)经8%SDS-PAGE蛋白电泳分离后，转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h。随后分别加入HSP70单克隆抗体(1∶5000)和β肌动蛋白单克隆抗体(1∶2500)4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶4000)室温孵育1 h，TBST洗膜5次，每次10 min。ECL发光试剂显影后，用Gel-Pro Analyzer软件进行积分吸光度分析。实验重复3次。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞存活率的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，加热对细胞存活率无明显影响。与加热组相比，槲皮素50 μmol·L－1组细胞存活率为(103 ±4)%，无明显改变，而槲皮素 100 μmol·L－1组细胞存活率明显降低(P ＜0.05)，槲皮素 150 μmol·L－1及 200 μmol·L－1组的细胞存活率分别为(77±4)%和(75±5)%，显著降低(P＜0.01)，呈浓度依赖性(r=0.94，P ＜0.05)。说明槲皮素能明显抑制C6细胞增殖。

表1 槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞存活率的影响Tab.1 Effect of quercetin on heat-induced glioma cell survival

2.2 槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞凋亡的影响

图1 Hoechst/PI检测结果显示，与正常对照组相比，加热对照组细胞凋亡率(7±2)%无明显改变。与加热对照组相比，槲皮素 50，100及 200 μmol·L－1组细胞凋亡率分别为(14±3)%，(23±6)%和(39±7)%，均有显著增加(P ＜0.05，P ＜0.01)。

表2和图2 annexinⅤ-FITV/PI检测结果显示，与正常对照组相比，加热对照组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均无明显改变;与加热对照组相比，槲皮素 50 μmol·L－1组细胞早期凋亡率显著增加，而晚期凋亡率无明显改变，而槲皮素100和200 μmol·L－1组细胞早期和晚期凋亡率均显著增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，细胞凋亡率最高为 59%。说明槲皮素处理C6细胞后，细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著增加。

表2 槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞凋亡率的影响Tab.2 Effect of quercetin on the rate of heat-induced glioma cell apoptosis

图1 Hoechst/PI双染法检测槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞凋亡的影响(×400).分组处理见表1.A:正常对照组;B:加热对照组;C:加热 +槲皮素50 μmol·L－1;D:加热 +槲皮素100 μmol·L－1;E:加热 +槲皮素200 μmol·L－1.箭头示凋亡的细胞.Fig.1 Effect of quercetin on heat-induced cell apoptosis detected by Hoechst/PI staining(×400).

图2 AnnexinV-FITC/PI检测槲皮素对热应激后神经胶瘤细胞凋亡的影响.分组处理见表1.A:正常对照组;B:加热对照组;C:加热 +槲皮素50 μmol·L－1;D:加热 +槲皮素100 μmol·L－1;E:加热 +槲皮素200 μmol·L－1.Fig.2 Effect of quercetin on heat-induced glioma cell apoptosis detected by annexinV-FITC/PI.

2.3 槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞HSP70蛋白表达的影响

如图3所示，加热组HSP70表达水平从正常对照组的0.22 ±0.01 升高到0.36 ±0.02，升高了39%(P ＜ 0.01)，槲皮素 200 μmol·L－1处理后降低至0.17 ±0.01，降低了53%(P ＜0.01)。

图3 Western印迹检测槲皮素对热应激后神经胶质瘤细胞热激蛋白70(HSP70)表达的影响.分组处理见表1.条带1:正常对照组;条带2:加热对照组;条带3:加热+槲皮素200 μmol·L－1组.Fig.3 Effect of quercetin on the expression of heat shock protein 70(HSP70)in heat-induced glioma cells by Western blotting.

3 讨论

研究表明，通过诱导细胞凋亡增强肿瘤治疗效果是目前肿瘤药物治疗的重要途径，槲皮素的抗肿瘤作用及其与诱导细胞凋亡的关系是目前研究的热点之一。文献报道槲皮素可以通过抑制Bcl-2蛋白表达、促进P53蛋白表达诱导大鼠脑胶质瘤C6细胞凋亡［6］，以及阻滞细胞增殖周期［7］、上调胱天蛋白酶 3［8］、抑制 HSP70 表达［9］以及改变线粒体膜电位［10－11］等途径抑制不同种类的肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。本研究结果表明不同浓度的槲皮素处理后C6细胞存活率明显降低，且证实C6细胞存活率降低主要是由于槲皮素引起了C6细胞凋亡。

作为分子伴侣，HSP主要参与新生多肽的折叠并参与抗原提呈、激素受体、细胞核受体结合和凋亡的过程，对维持细胞正常的生理功能发挥重要作用［12－16］。1982 年 Adams 等［15］证实，生物细胞(包括原核细胞和真核细胞)温度增高时均可合成一类具有生物学活性及其多种生理功能的蛋白质，即诱导型HSP。Western印迹结果显示，42℃热应激处理后HSP70表达明显高于正常细胞，而槲皮素处理后，HSP70表达水平明显低于加热对照组，这表明槲皮素抑制了热应激后C6细胞HSP70的表达。

研究证实，下调HSP70的表达可以抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡［17］。HSP70呈高表达现象并可能与肿瘤细胞中错误折叠的蛋白高表达，对HSP70的再折叠功能的需求增加有关，或是由于肿瘤内微环境中低氧、葡萄糖供给不足更适宜HSP70蛋白的高表达［18－20］。这种异常活跃的代谢需要更多的HSP70来调节和稳定，同时肿瘤细胞中突变或异常蛋白质的存在刺激HSP70的合成，使其呈现高表达水平;另一方面，大量表达的HSP70又通过下调凋亡相关基因、蛋白及蛋白酶活性而抑制细胞凋亡，使细胞进一步异常增殖［20］。因此，本实验结果表明槲皮素诱导热应激后C6细胞凋亡的可能机制与抑制热应激后HSP70的表达有关，为深入阐明槲皮素诱导C6细胞凋亡的机制提供重要依据。

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