长期游泳运动对自发性高血压大鼠主动脉血管内皮细胞HSP90表达的影响

任彩玲 王学柱 张钧

1 江西省赣南医学院康复学院（赣州 341000）

2 解放军国际关系学院军事与体育教研室

3 扬州大学运动人体科学研究所

目前研究已经证实[1，2]，热休克蛋白 90（HSP90）在心血管疾病的发生、发展和血流动力障碍中起到重要的作用，主要是通过调节NOS的成熟、胞内转运和活性，增加NO的释放。在多种组织，如心肌细胞、淋巴细胞等，运动可以引起HSP表达的变化，但在主动脉血管内皮细胞中是否也存在这样的变化尚未见报道。近年来，HSP90对心血管系统作用的研究结果提示[3]，血管内皮细胞的HSP90可以作为一种治疗心血管疾病的药物作用靶点。与运动有关的心血管功能改善是否与运动后主动脉血管内皮细胞HSP90表达有关呢？本研究观察了长期游泳运动后自发性高血压大鼠（SHR）主动脉血管内皮细胞HSP90表达变化，并分析其与主动脉血管内皮功能的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及喂养

选用8只6周龄雄性Wistar大鼠为正常对照组，16只6周龄雄性SHR大鼠[均由北京维通利华公司提供，SCXK（京）2007-0001]，体重 170 ～ 200 g，随机分为SHR运动组和SHR对照组，每组8只。分笼饲养，每笼4只，饲养笼选用塑料制品并配不锈钢罩、塑料吸水瓶和不锈钢吸水管，按国家标准固定混合饲料喂养，各组大鼠每天自由进食饮水。室温22～24℃，湿度为40～60%，自然光照。

1.2 训练方案

SHR运动组进行90 min无负重有氧游泳运动。游泳缸体积为150 cm×60 cm×70cm，水深60 cm，内壁光滑，水温31±1℃。适应性游泳1周，时间分别为10、20、30、40、50、60 min，以后每次游泳90 min，每周6次，持续8周。SHR对照组及正常对照组均不运动，分笼饲养，均自由进食饮水。

1.3 取材与指标检测

1.3.1 血压测定

采用RBP-I型大鼠血压心率测定仪（中日友好医院临床研究所）每周测定所有大鼠血压1次。为减少测量中的误差，在首次测量前，将SHR装入固定网套内，装上尾套，每天适应性固定30分钟，共持续1周，之后再进行第一次测量，且连续测量3天取平均值作为其初始血压值。

1.3.2 主动脉血管内皮细胞HSP90检测

按Jaffe等[4]的方法稍加改进，采用外翻胶原酶消化法分离主动脉血管内皮细胞：大鼠在末次游泳后24小时，戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后剖开腹腔，分离主动脉至髂总动脉分支处，在靠近髂总动脉分支处截取1.5 cm长血管，取出放入D-Hanks液中。无菌剥除血管外膜的脂肪和纤维组织并称重，D-Hanks液冲洗血管腔。将血管移入另一有培养液的培养皿中，用镊子将血管外翻，使内膜暴露出来，用灭菌线将血管两端扎紧。将血管转移到含有2.5g/L Ⅱ胶原酶的培养皿中，放入37℃水浴箱中，分别于15 min、30 min、45 min、60 min、2 h收集胶原酶，1500 r/min离心10 min，弃上清，用PBS洗涤1次，即得到分离的血管内皮细胞。

采用ELISA方法检测主动脉血管内皮细胞HSP90。检测过程严格按照试剂盒要求操作，原装试剂盒由美国ADL公司提供。然后以标准品OD值为纵坐标，以浓度（标准品浓度为0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 ng/ml）为横坐标绘制标准曲线。

1.4 统计学分析

实验结果均以均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，差异显著性为P < 0.05，非常显著性为P < 0.01。

2 结果

2.1 血压

由表1可知，实验前两SHR组血压均显著高于正常对照组（P < 0.01），但两SHR组之间血压无显著性差异；8周实验后，两SHR组血压均显著高于正常对照组（P < 0.01），SHR运动组血压显著低于SHR对照组（P < 0.01）。

表1 3组大鼠血压比较（mmHg）

2.2 主动脉血管内皮细胞HSP90表达

由表2可知，8周实验后，SHR运动组大鼠主动脉血管内皮细胞HSP90含量显著高于SHR对照组（P < 0.05）。

3 讨论

表2 3组大鼠HSP90表达比较

有关运动与高血压之间关系的研究表明[5]，长期中等强度有规律的运动能降低患者安静时血压，对高血压有一定的防治作用。本实验结果显示，SHR运动组大鼠血压较SHR对照组显著下降，且SHR运动组大鼠血压在第5周时与SHR组相比已有显著性差异。说明运动有一定的降压作用，能有效抑制血压进一步升高。8周游泳运动后，SHR运动组大鼠血压较运动5周时显著降低，说明运动对高血压的作用受运动时间的影响，持续时间越长，降压效果越好，因此高血压患者应坚持长期适宜的运动。

HSP90在心血管疾病中的作用主要通过与eNOS结合影响NO的合成，并调节NO与O2-之间的平衡，维持血管内皮的正常功能[6]。研究证实[7]，运动可以诱导HSP90表达，本实验通过研究运动对SHR大鼠主动脉血管内皮细胞HSP90的影响发现，SHR运动组大鼠与SHR对照组相比，HSP90表达显著升高，说明运动可以使SHR大鼠主动脉血管内皮细胞HSP90的表达增加。HSP90不仅具有“分子伴侣”，提高细胞的应激能力，抗细胞凋亡，抗氧化的作用，还具有调节细胞活性和调控信息传递通路作用[8]，促进eNOS合成分泌NO。HSP90对血管内皮功能影响的可能机制有HSP90与 eNOS的耦联途径[9]，PI3K/Akt信号途径[10]，Ras/Raf/MEK/ERK 信号途径[11，12]及 c-Src信号途径[13]。

综上，长期适宜有氧运动可明显促进SHR大鼠主动脉血管内皮细胞HSP90表达，降低血压。

[1]Moleda L，Jurzik L，Froh M，et al. Role of HSP-90 for increased nNOS-mediated vasodilation in mesenteric arteries in portal hypertension. World J Gastroenterol，2010，16（15）：1837-44.

[2]Michel T，Vanhoutte PM. Cellular signaling and NO production. Pflugers Arch，2010，459（6）：807-16.

[3]Harris MB，Ju H，Venema VJ，et al. Role of heat shock protein 90 in bradykinin-stimulated endothelial nitric oxide release. Gen Pharmacol，2000，35（3）：165-70.

[4]Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbillical veins identification by morphologic and immunologic criteria.Clin Invest, 1973, 53（11）：2745-2756.

[5]Petrella RJ. How effective is exercise training for the treatment of hypertension. Clin J Sport Med，1998，8：224-231.

[6]Pritchard KA Jr，Ackerman AW，Gross ER，et al. Heat shock protein 90 mediates the balance of nitric oxide and superoxide anion from endothelial nitric-oxide synthase.Biol Chem，2001，276（21）：17621-17624.

[7]Shastry S，Toft DO，Joyner MJ.HSP70 and HSP90 expression in leucocytes after exercise in moderately trained humans. Acta Physiol Scand，2002，175（2）：139-46.

[8]俞峻，马康涛，张衡. 分子伴侣的多重功能. 生物学与生物物理进展，1998，25（1）：106-110.

[9]Harris MB，Mitchell BM，Sood SG，et al. Increasednitric oxide synthase activity and Hsp90 association in skeletal muscle following chronic exercise. Eur J Appl Physiol，2008，104（5）：795-802.

[10]赵晓辉，彭毅志，王元元. 缺氧复氧心肌细胞中HSP90对AKT表达的调控. 现代生物医学进展，2007，7（4）：521-524.

[11]丁桂霞，张爱华，陈荣华. Ras/Raf/ERK信号传导通路在肾脏疾病中作用的研究进展. 国外医学儿科学分册，2000，27（5）：231：233.

[12]Zhai B，Yang H，Mancini A，Leukotriene B（4） BLT receptor signaling regulates the level and stability of cyclooxygenase-2（COX-2） mRNA through restricted activation of Ras/Raf/ERK/p42 AUF1 pathway. J Biol Chem，2010，285（31）：23568-80.

[13]Callera GE，Montezano AC，Yogi A，et al. c-Srcdependent nongenomic signaling responses to aldosterone are increased in vascular myocytes from spontaneously hypertensive rats. Hypertension，2005，46（4）：1032-8.