2个抗白粉病小偃麦异附加系的GISH鉴定

张晓军，畅志坚，阎晓涛，詹海仙，李 欣

（山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

小麦白粉病（Blumeria graminis f.sp.tritici）是影响小麦高产稳产的主要病害之一，近年来有愈来愈流行的趋势，培育和推广抗病品种是控制该病害流行的有效措施。小麦的野生近缘种属植物中蕴藏着许多对小麦品种改良非常重要的基因，通过远缘杂交等方法选育附加系是利用近缘种属有益基因的重要途径[1-2]。

中间偃麦草对小麦白粉病免疫[3]，具有多种抗病、抗逆性状，易与小麦杂交，且其优良基因易于在小麦背景中表达，是小麦改良育种中重要的基因源。国内外许多学者已将偃麦草的许多有益基因转移到小麦中[4-5]。

本研究以来源于中间偃麦草的八倍体小偃麦TAI7047为供体，以高感白粉病的优质小麦品种晋太170为受体，通过回交转育的方法，从其BC1F4后代群体中筛选出2个稳定的抗白粉病株系CHadd 7001和CHadd 7002，并运用形态学、细胞学、抗病性、基因组原位杂交的研究方法对其进行了分析、鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料包括：从八倍体小偃麦TAI7047（2n=56）与普通小麦晋太170的BC1F4群体中选育出的2个稳定株系CHadd 7001和CHadd 7002；二倍体拟鹅冠草（St基因组）；中国春。

1.2 方法

1.2.1 制片 在24℃恒温箱中将种子培养至露白，4℃冰箱中处理24 h，再转移到24℃恒温箱中培养，待根长1.5～2.0 cm时，剪取生长健壮的根尖，冰水处理24 h，卡诺固定液I固定。检测时，根尖用0.2mol/L盐酸室温解离8 h以上，45%醋酸压片，相差显微镜下进行观察[6]。挑选中期分裂相多且分散好的片子，液氮冷冻揭片，气干，置于干燥洁净的载玻片贮藏盒中，-20℃保存备用。

1.2.2 基因组总DNA的提取 采用CTAB法[7]提取基因组DNA，略有改动。

1.2.3 封阻DNA和探针DNA的制备 以普通小麦中国春的基因组DNA作为封阻DNA，以地高辛标记的二倍体拟鹅冠草（St基因组）的基因组DNA作为探针DNA。

1.2.4 基因组原位杂交（GISH）

1.2.4.1 预处理 滴加100μL 70%的甲酰胺，80℃处理2min。依次放到-20℃预冷的不同梯度酒精中（70%，95%，100%）各5min。处理完将片子夹出，使其自然干燥。

1.2.4.2 配置杂交液 去离子甲酰胺7.5μL；20×SSC 1.5μL；ssDNA 1.5 μL；50%DS 3 μL；封阻DNA 1μL；Probe DNA 1μL。上述体系配置完成后，瞬时离心（闭光），然后80℃变性10min。变性完后，迅速放到冰上处理5min以上。

1.2.4.3 杂交 把1.2.4.2杂交液15μL滴加到载玻片上的染色体处，盖上盖玻片，然后在周围涂上无色指甲油保温密封。放入湿润的盒子里37℃反应8 h以上。用镊子将指甲油剥掉，将标本片浸入2×SSC染色缸中，轻轻摇动使盖片脱落，清洗20min，然后在1×PBS处理5min。离心管中加入0.5%小牛血清100μL，再加入0.5μL Antidigoxigenin Fab Fragments，涡旋混匀，滴加到盖片上，盖上盖片，37℃条件下反应45min。

1.2.4.4 清洗 将片子放入1×PBS中，轻摇使盖玻片脱落，后用1×PBS清洗3次，每次5min。清洗好的片子在室温下气干，加上1滴含有1μg/mL Propidium iodide（PI）的抗褪色剂，盖上盖玻片。

1.2.4.5 镜检及照相 镜检在Leica DM RA2荧光显微镜下进行，荧光信号分别采用蓝色（B）激发滤光片组和绿色（G）激发滤光片组检测。经PI染色后，检测到已标记的探针杂交信号应为黄色或黄绿色，其他染色体为橙红色。图像用Leica DFC 500采集。

2 结果与分析

本研究以普通小麦晋太170为受体亲本，采用回交转育法，以八倍体小偃麦TAI 7047作为转移中间偃麦草基因组有益基因的桥梁材料，将中间偃麦草的抗白粉病基因导入普通小麦中。通过对转育的自交后代BC1F4进行抗病性鉴定，从47个株系中筛选出2个对小麦白粉病免疫的株系CHadd 7001和CHadd 7002，说明TAI7047所携带的中间偃麦草的抗病基因已成功导入普通小麦中。有丝分裂结果表明，这2个株系的染色体数目均为2n=44，因此可以初步判断为2个小麦-中间偃麦草的抗白粉病异附加系[6]。

采用地高辛标记的二倍体拟鹅冠草基因组DNA作探针、普通小麦中国春基因组DNA作封阻，进行荧光原位杂交，GISH的结果表明，CHadd 7001和CHadd 7002株系中已分别成功导入1对中间偃麦草的染色体，即图中检测到探针杂交信号为黄色或黄绿色的染色体；而其他染色体上未检测到杂交信号，呈橙红色（图1，2）。从图1，2可以看出，杂交信号出现在染色体的不同位置。其中，CHadd 7001附加的外源染色体上，黄绿色的杂交信号出现在着丝点位置附近，由此可知，其所附加的外源染色体来自中间偃麦草的Js组染色体；而CHadd 7002附加的染色体杂交信号出现在两臂的端部位置，由此可知，其所附加的外源染色体来自中间偃麦草的J组染色体[8]。根据根尖细胞有丝分裂核型分析、减数分裂结果、GISH带型和杂交信号的分布，得出CHadd 7001和CHadd 7002为2个不同的小麦-中间偃麦草双体异附加系。

3 讨论

基因组原位杂交是20世纪80年代末发展起来的一种以亲本之一的总基因组DNA作探针，另一亲本的基因组DNA作封阻的原位杂交技术。它可以有效分析远缘杂交后代染色体组的组成；系统研究多倍体中基因组之间的亲缘关系、基因组的组成及起源；准确鉴定附加系、代换系和易位系，并对其中外源染色体或染色体片段的来源、大小、数目及发生位点进行检测和定位[9]。在应用GISH检测八倍体小偃麦及其衍生品系过程当中，通常使用二倍体拟鹅冠草基因组DNA作探针，这种探针既与小麦基因组远同源，又能同时分辨出 JJsS（EeEbSt）3 个基因组[10-11]。

本研究从八倍体小偃麦TAI 7047与普通小麦的杂交后代中选育了2个小麦-中间偃麦草异附加系CHadd 7001与CHadd 7002，它们均来自1对亲本的杂交后代，遗传背景简单，在遗传学研究中具有一定的利用价值。由于这2个附加系均免疫当前我国流行的白粉病菌E09，E21，E26等生理小种，农艺性状接近小麦亲本（亲本晋太170农艺性状好，品质优良，生产上有较大推广面积），因此，可以作为小麦抗病育种的新抗源，也可与普通小麦进一步回交来创造抗病代换系和易位系。

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［2］ 郭明慧，裴自友，温辉芹，等.抗白粉病小麦-簇毛麦易位系92R149 的利用研究[J].山西农业科学，2010，38（4）：8-10.

［3］ 王黎明，李萍，王合坚，等.早熟型小麦种质系山农0057的细胞学鉴定[J].河南农业科学，2007（10）：27-29.

［4］ 高智，韩方普，何孟元，等.应用荧光原位杂交和染色体配对研究八倍体小冰麦中2的染色体组构成及染色体特征[J].植物学报，1999，41（1）：25-28.

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［11］ Wang R R，Zhang X Y.Characterization of the translocated chromosome using fluorescence in situ hybridization and random amplified polymorphic DNA on two Triticum aestivum-Thinopyrum intermedium translocation lines resistant to wheatstreakmosaic or barley yellow dwarf virus[J].ChromosomeResearch，1996，4（8）：583-587.