GDF-8干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞最佳条件研究

靳 辉，黄 洋，岳文斌，张晓强，张春香

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

1997年，美国John Hopkins大学的McPherron等[1]从小鼠骨骼肌cDNA文库中发现了一种新的生长分化因子（Growthand Differentiation Factor，GDF），该因子只有1个可读框，可编码376个氨基酸，具有转化生长因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）家族的典型特征，但通过与TGF-β家族其他成员比较，其与TGF-β家族其他成员的同源性很低，最高仅为45%，因而列为TGF-β家族的一类因子——GDF-8。就C端而言，GDF-8基因在不同物种间十分保守，大鼠、人、猪、鸡、火鸡、小鼠的同源性达100%[2]。

GDF-8是一种对骨骼肌生长具有负调控作用的重要细胞因子，GDF-8基因的突变或缺失会导致肌肉细胞的增生和肌纤维的肥大，该基因敲除的动物具有生长速度快、肌肉含量高、脂肪含量少的特点[1]。利用基因敲除技术研究GDF-8功能时发现，敲除GDF-8基因的小鼠骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，但在其他生长发育性状上没有发现任何表现型的差异[1]。GDF-8基因自然突变的双肌牛——比利时蓝牛[3]，其肌肉数量较一般品种多20%左右，而且肉质鲜嫩，极大地提高了饲料转化效率。因此，建立敲除GDF-8基因的转基因动物具有广阔的应用前景。

本试验采用脂质体转染法，用红色荧光蛋白（RFP）标记的GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞，探索其最佳转染条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 表达载体与菌种 红色荧光蛋白标记的GDF-8基因干扰质粒和大肠杆菌DH5α为山西农业大学动物科技学院遗传育种与繁殖实验室保存。

1.1.2 试剂 DMEM/F12（Boster），胎牛血清，胰蛋白酶（Solarbio），双抗（Sigma），LipofectamineTM2000（invitrogen），Opti-MEM（GIBCO）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养液的配制 在DMEM/F12中添加10%胎牛血清（FBS）、1%双抗所构成的培养基（简称基本培养基）用于绵羊耳成纤维细胞的原代培养和传代培养。在DMEM/F12中添加10%FBS，所构成的培养基（简称无抗培养基）用于GDF-8基因干扰质粒的转染。

1.2.2 靶细胞的培养 取1周龄绵羊新鲜耳组织，采用组织块贴壁培养法进行原代、传代培养和冻存，建立绵羊耳成纤维细胞系[4-7]，为脂质体介导的GDF-8基因干扰质粒转染提供靶细胞。

1.2.3 脂质体法介导转靶细胞 将传至4代已经纯化的耳成纤维细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为10 000个。待细胞汇合至70%～80%时，将基本培养基换为无抗培养基。更换培养基24 h后，细胞汇合度已达到90%，按如下步骤进行GDF-8基因干扰质粒的转染：（1）将不同量的质粒 DNA（0.1，0.2，0.4，0.6 μg） 和不同量的LipofectamineTM2000（0.1，0.5，1.0，1.5 μL）分别稀释于25μL的Opti-MEM中。然后，将稀释好的不同量质粒DNA和不同量的LipofectamineTM2000两两混合，室温搁置20min，构成转染液，加入一个培养孔中，每个组合重复3个孔，12 h后更换为基本培养基。48 h荧光倒置显微镜下检测每个组合表达红色荧光蛋白的阳性细胞数，用以筛选最佳质粒DNA用量和最佳LipofectamineTM2000用量。检测时每个转染处理组随机选取5个视野，检测表达红色荧光蛋白的阳性细胞数，计算每个处理组的阳性细胞数平均值。（2）用筛选出的最佳质粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量构成转染液，分别于 3，6，12，24，48 h 后更换为基本培养基，每个时间重复3次。48 h荧光倒置显微镜下检测不同转染时间的阳性细胞数，用以筛选最佳转染时间。检测方法同（1）。

2 结果与分析

2.1 转染的最佳质粒DNA用量和脂质体用量

试验结果表明，当DNA用量为0.4μg，脂质体用量为1.0μL时，不同时间观察转染效率均较高。不同时间观察的转染效果如图1所示。

48 h计算5个视野平均阳性细胞数，结果如表1所示。

2.2 转染的最佳时间

用筛选出来的最佳质粒DNA量0.4μg和脂质体量1.0μL转染绵羊耳成纤维细胞，计算不同时间后的阳性细胞数，结果表明，转染时间为6 h时，可以获得较高的转染效率（表2）。

表1 48 h不同质粒DNA量和不同脂质体量转染5个视野平均阳性细胞数 个

表2 不同转染时间对转染效果的影响

3 讨论

3.1 红色荧光蛋白（RFP）和阳离子脂质体法

本试验采用红色荧光蛋白（RFP）标记GDF-8基因干扰质粒，RFP在靶细胞内表达，可以直接在荧光倒置显微镜下观察，便于识别转染阳性细胞，因此，RFP作为一种理想的标记物应用于转基因领域。目前，阳离子脂质体法常作为转染外源基因的手段[8]。研究发现，多种脂类可以在合适的条件下形成小的单层阳离子脂质体，这些脂质体的表面带有正电荷，能被DNA的磷酸根所吸附，同时也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，通过细胞融合或胞吞作用使脂质体和DNA复合物进入细胞质，最终进入细胞核并使外源基因整合到染色体中进行基因的表达[9]。由于不同类型的细胞吸收大小各异颗粒的能力不尽相同，针对不同细胞类型以及所介导的核酸（DNA，RNA或核苷酸），选择合适的脂质体是十分重要的。LipofectamineTM是一种新型脂质体，其独特的精胺基团强正电子头部可以同时与带负电的DNA和细胞形成复合物，大大提高了转染效率。LipofectamineTM作为载体在体内外基因转染的研究中已有很多文献报道[10]。该方法具有高效、简便、对细胞损伤小和容易重复等优点。

3.2 影响转染效果的各种因素

本试验探讨了LipofectamineTM2000介导的GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件。首先在转染前24 h，将含抗生素的基本培养基更换为无抗生素的无抗培养基，因为在抗生素存在的情况下不利于转染。另外，试验探索了转染时的最佳质粒DNA和脂质体用量以及最佳转染时间，由于不同细胞达到最佳转染效果时所用的DNA量和脂质体量是不同的。由本试验结果可知，当脂质体量一定时，转染效率会随DNA量的增加而增加，但有一个最大值，超过这个最大值时转染效率降低。当DNA量一定时，转染效率会随脂质体量的增加而增加，但也有一个最大值，超过最大值后转染效率也会降低。因为高浓度的脂质体对细胞有毒性，会导致细胞萎缩、死亡。此外，转染时间一定程度上也影响着转染效率的高低。以上结果表明，DNA和脂质体用量以及转染时间会影响转染效率，欲提高转染效率还有待进一步研究。

4 结论

用GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件为：DNA用量为0.4μg，脂质体用量为1.0μL，转染时间为6 h。

［1］ McPherron AC，LawlerAM，Lee SJ，etal.Regulation ofskeletal musclemass in mice by a new TGF-βsuperfamilymember[J].Nature，1997，387（6628）：83-90.

［2］ Alexandra CMcPherron，Se-Jin Lee.Doublemuscling in cattle due tomutations in themyostatin gene[J].Proc Natl Acad Sci，1997，94（23）：1457-1461.

［3］ Grobet L，Mani I J，Poncelet D，et al.A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle[J].NatGenet，1997，17（1）：71-74.

［4］ 李桂芳，李岩，赵宗胜，等.绵羊耳成纤维细胞的体外培养[J].中国草食动物，2003，23（4）：5-7.

［5］ 万发春，刘晓牧，宋恩亮，等.用于保种的蒙山牛耳成纤维细胞的培养研究[J].华北农学报，2009，24（增刊）：109-112.

［6］ 王亮，刘婷婷，彭涛.荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究[J].黑龙江畜牧兽医，2006（5）：9-11.

［7］ 关伟军，马月辉.小尾寒羊耳组织成纤维细胞系的建立与生物学特性研究[J].畜牧兽医学报，2005，36（5）：511-516.

［8］ Raniere R Oliveira.Effectiveness of liposomes to transfect livestock fibroblasts[J].GMR，2005，4（2）：185-196.

［9］ 胡义德，高铺.Fugene-6，一种介导体外真核细胞高效率基因转染的新方法[J].免疫学杂志，2001，17（2）：138-140.

［10］ Madry H，Reszka R，Bohlender J，et al.Efficacy of cationic liposome-mediated gene transfer tomesangial cells in vitro and in vivo[J].JMo1Med，2001，79（4）：184-189.