鱼腥草对半滑舌鳎非特异免疫活性的影响

集美大学水产学院 刘金海 郑志斌 张 伟 谭大明

半滑舌鳎属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，俗称“龙脷”、牛舌头、鳎目、鳎板、鰙鳎、细鳞、鳎米等，为名贵海水鱼类，主要分布于我国的渤海、黄海海域，是一种暖温性底栖大型鱼类，生长速度快，肉味鲜美，经济价值很高（徐永江等，2005；姜言伟和万景瑞，1998；Engstad 等，1992）。 近年来，鱼腥草对小鼠、大鼠及人类的抗菌、免疫研究成果报道较多，但其对鱼类非特异免疫能力影响的报道较少。基于鱼腥草对小鼠、大鼠及人类具有良好免疫活性及半滑舌鳎病害频发的现状，本文初步开展了鱼腥草对半滑舌鳎非特异免疫活性影响的研究，为合理配制半滑舌鳎免疫促生长饵料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼 半滑舌鳎活鱼（93.78±2.97）g

1.1.2 试剂及药品 鱼腥草（购于厦门市集美区石鼓路大药房），肝素钠、KH2PO4、甲醛、NaOH 溶液（0.5 mol/L）（国际集团化学试剂有限公司），Na3PO4（宜兴市第二化学试剂厂），姬姆萨染料（上海晶天生物科技有限公司），甘油（福建省厦门向阳医药化工厂），甲醇（上海化学试剂总厂），乙醇（75%）（广东光华化学厂有限公司），高锰酸钾（芜湖市辉隆中信化工有限公司），牛肉膏、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司），琼脂、NaCl（广东省汕头市西陇化工厂），所用试剂均为AR级。

1.2 仪器与设备 医用型净化工作台（SW-CJZFD）、生物培养箱（LRH-250-G）、显微镜（Leica DF40）、可见分光光度计（V1100）、高压蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-SII）、离心机（TGL-16C）、电子天平（BS110S）、双螺杆制粒机（CD4 × 1TS多功能催化剂成形机）、电炉、接种环、酒精灯、试管、棉塞、培养皿、锥形瓶、量筒、玻璃棒、精密pH试纸、2 mL针管、解剖盘、血球计数板、计数器、载玻片、盖玻片。

1.3 试验方法

1.3.1 试验用鱼养殖管理 试验用水族箱（长60 cm、宽40 cm、高40 cm）10个，均具有自动控温、充氧及水循环过滤装置。每箱放15尾半滑舌鳎暂养，每晚18∶00和22∶00各投喂基础饵料一次。15 d后，测定其免疫指标作为底值。之后投喂免疫饵料，每10 d测免疫指标一次，共测3次。

1.3.2 基础饵料配方与制备 先将鱼粉、沙蚕粉、豆粉、淀粉、矿物盐、酵母粉和预混料等粉状成分按所需用量混合均匀，再将搅碎的牡蛎肉、鱼油与粉状料混匀，最后制粒备用。基础饵料组成见表1。

表1 基础饲料配方 %

1.3.3 试验饲料的配制 免疫饵料配方见表2。按照该配方表配制免疫饵料。称取20、40、60 g鱼腥草，分别加适量水熬制浓缩，熬制3次并分别合并浓缩液。将所得3种浓缩液（1#、2#、3#）分别与基础饵料混匀，制成3种免疫饵料，晾干备用。

表2 试验饵料配方（每100 g含量）

1.3.4 培养基的配制 使用002营养肉汁琼脂培养基配方，参照沈萍等（1999）方法配制。血清溶菌酶活性的测定、吞噬能力的测定、免疫器官（脾脏）指数测定参照刘金海等（2010）方法。

1.4 数据处理 采用SPSS 16.0对试验数据进行处理。

2 结果

2.1 鱼腥草对半滑舌鳎溶菌酶活性的影响 对照组溶菌酶活性在 0、10、20、30 d时均无显著变化（P＞0.05）。试验开始10 d后，各试验组溶菌酶活性均显著高于对照组（基础饵料组），随试验时间延长，各试验组溶菌酶活性显著性升高（P＜0.05）。30 d时，试验组3的溶菌酶活性最高（见表3）。

表3 半滑舌鳎溶菌酶活性

2.2 鱼腥草对半滑舌鳎白细胞吞噬活性的影响对照组白细胞吞噬活性（吞噬百分比和吞噬指数），在 0、10、20、30 d 时变化不大。 试验开始 10 d后，各试验组白细胞吞噬活性均高于对照组（基础饵料组），各试验组不同时间点上白细胞吞噬活性较对照组均存在显著性差异（P＜0.05）；除0d外，其余各时间点，随鱼腥草添加剂量增多，试验组1、2、3 的白细胞吞噬活性依次增强（P ＜ 0.05）。30d时，试验组3的白细胞吞噬活性最高（见表4、5）。

表4 半滑舌鳎吞噬细胞的吞噬百分比

表5 半滑舌鳎吞噬细胞的吞噬指数

2.3 鱼腥草对半滑舌鳎免疫器官（脾脏）指数的影响 见表6。试验组与对照组之间、各试验组之间脾脏指数均无显著性差异（P＞0.05）。

表6 半滑舌鳎脾脏免疫指数

3 讨论

3.1 鱼腥草对半滑舌鳎溶菌酶活性的影响 溶菌酶活性是评价鱼类免疫力的常用指标之一（黄洪敏等，2005）。溶菌酶是由淋巴细胞分泌的碱性溶解酶，当机体受到病原攻击时，白细胞聚集在感染区，包围异物进行吞噬，此时吞噬细胞活性增强，吞噬细胞中含有溶菌酶，因此随着吞噬活性的增强也导致了溶菌酶活性的变化（张耀武等，2008）。应惠芳（2006）研究表明，艾叶和鲜鱼腥草对金葡球菌、白葡球菌及伤寒杆菌有较强的抗菌作用。袁吕江等（2005）发现，鱼腥草素同系物能够提高小鼠血清溶菌酶活力，且随浓度增加增幅加大，最大可达20%。体外试验时，在低浓度时鱼腥草素同系物明显提高溶菌酶的活性，超过一定浓度时则表现出抑制溶菌酶的活性。本研究发现，投喂添加鱼腥草熬制浓缩液的免疫饵料，可以提高半滑舌鳎溶菌酶活性，在一定剂量内，随试验时间延长和鱼腥草剂量增加而升高。

3.2 鱼腥草对半滑舌鳎吞噬活性的影响 众多的研究表明，鱼腥草可以增加试验动物的特异性或非特异性免疫能力。任翠玉等（1998）用X-射线照射每只口服鱼腥草营养液0.4 mL/d的小鼠及对照组1个月后，口服鱼腥草营养液的小鼠血清溶血素含量、巨噬细胞吞噬百分率指数明显高于对照组。鱼腥草注射液可增加中性粒细胞的化学发光值，而对单核细胞无显著影响，表明鱼腥草注射液可能参与调整中性粒细胞氧化过程（呼吸爆发），并增加中性粒细胞的杀菌能力（王潮临等，1997）。合成鱼腥草素可以刺激巨噬细胞呼吸爆发，提高细胞内钙离子浓度水平，促进T细胞分泌IL-2，说明鱼腥草素可能局域激活巨噬细胞和T淋巴细胞的作用（Wang等，2002）。另有研究表明，鱼腥草素提高细胞免疫能力可能是由于它靠疏水吸附作用与免疫细胞结合而发生作用；鱼腥草素同系物在巨噬细胞上吸附后，通过某种途径对巨噬细胞的酶系发生激活作用，从而提高了动物的免疫功能。且有试验表明，延长鱼腥草素碳链的长度有助于寻找到有高免疫促进作用的新型鱼腥草素衍生物（袁吕江等，2004）。本研究发现，试验期间投喂添加鱼腥草熬制浓缩液的免疫饵料，可明显提高半滑舌鳎白细胞的吞噬活性，随试验时间延长和鱼腥草量的增加而增强，这与上述许多研究结果相一致。

3.3 鱼腥草对半滑舌鳎免疫器官（脾脏）指数的影响 硬骨鱼类的脾脏在造血和免疫反应方面都起着重要的作用。脾脏是红细胞、中性白细胞和粒细胞生成、贮存与成熟的主要器官。其重量变化与机体免疫状况变化密切相关（葛立安等，2008）。但乔志刚等（2008）分析认为，鱼类的免疫器官重量相对较小，其增加或减少反映到免疫器官指数上变化不显著。袁吕江等（2004）研究表明，随着鱼腥草素同系物碳原子数增加，对受试小鼠免疫器官重量无影响。本免疫试验设计为30 d，半滑舌鳎免疫器官（脾脏）指数不随鱼腥草添加剂变化而变化，本研究结果与以上研究结果相一致。

4 结论

（1）试验组半滑舌鳎溶菌酶活性和白细胞吞噬活性均高于对照组，且随试验时间延长而增高，随鱼腥草添加剂量增多而增强。

（2）鱼腥草添加剂量对半滑舌鳎免疫器官（脾脏）指数影响不显著（P＞0.05）。

（3）以60 g鱼腥草熬制的浓缩液为添加剂制成的试验饵料，对增强半滑舌鳎非特异免疫活性效果较好。

[1]葛立安，高明辉，徐海涛，等.亚硝酸盐对异育银鲫免疫功能的影响[J].饲料工业，2008，29（10）：27 ～29.

[2]黄洪敏，邵健忠，项黎新.鱼类免疫增强剂的研究现状与进展[J].水产学报，2005，29（4）：552 ～554.

[3]姜言伟，万景瑞.渤海半滑舌鳎早期形态及发育特征研究[J].海洋水产研究，1988，9：193 ～198.

[4]刘金海，王宏志，钟志晓.壳聚糖等四因素对半滑舌鳎非特异免疫的研究[J].饲料研究，2010，10：7 ～11.

[5]乔志刚，郭向辉，张英英，等.两种怀药对黄河鲤幼鱼非特异性免疫的影响[J].饲料工业，2008，29（16）：25 ～27.

[6]任翠玉，周彦钢，凌文娟，等.鱼腥草营养液的研制[J].食品与机械，1998，1：13 ～14.

[7]沈萍，范秀容，李广武.牛肉膏蛋白胨培养基的制备[M].微生物试验，1999，50 ～54.

[8]王潮临.鱼腥草等中草药对外周血中性粒细胞和单核细胞化学发光影响的研究[J].广西医科大学学报，1997，14（2）：20 ～22.

[9]徐永江，柳学周，马爱军，等.半滑舌鳎胚胎发育及仔鱼生长与盐度的关系[J].海洋科学，2005，29（11）；39 ～43.

[10]应惠芳.鱼腥草等5种中草药对10种常见细菌体外抑菌实验研究[J].时珍国医国药，2006，17（11）：2202 ～2203.

[11]袁吕江，李学刚，何红梅.鱼腥草素同系物对小鼠免疫影响的研究[J].中医药学报，2004，32（5）：25 ～29.

[12]袁吕江，李学刚，何红梅.鱼腥草素同系物在体内外对溶菌酶活力的影响[J].中华中医药杂志，2005，20（增刊）：268 ～269.

[13]张耀武，郭黛健，陈万光.壳聚糖对异育银鲫生长及非特异性免疫功能的影响[J].水利渔业，2008，28（4）：50 ～51.

[14]Engstad R E，Robertsen B，Frivold E.Yeast glucan induces increase in activity of lysozyme and complement-mediated haemolytic activity in A tlantic salmon blood[J].Fish Shell Immunol，1992，2：287 ～297.

[15]Wang D Y，Yu Q H，Eikstadt P，et al.Studies on adjuvanticity of sodium houttuyfonate and its mechanism [J].International Immunopharmacology，2002，2：1411 ～1418.