消肿喷剂促进急性软组织损伤大鼠损伤修复的实验研究

牛淑亮 刘凤霞 王海龙 廖 静 新疆医科大学基础医学院(乌鲁木齐 830011)

消肿喷剂为苏栀消肿膏改良制剂,主要由苏木、栀子、姜黄、延胡索、制乳香、制没药、三七、血竭、冰片等多味中药组成,具有活血祛瘀、舒筋活络、消肿止痛作用。临床应用治疗跌打损伤,各种骨折后软组织肿胀、疼痛 1583例 ,效果良好。为探讨其促进急性软组织损伤修复的作用机理,笔者进行了实验观察:

1 实验材料

1.1 实验动物 健康 SD大白鼠 48只,雌雄各半,体重200～ 220g(新疆医科大学大学实验动物中心提供)。

1.2 实验用药 消肿喷剂 (苏木、栀子、姜黄、延胡索、制乳香、制没药、三七、血竭混匀,浸泡于 60%酒精中,每天搅拌 1次,10d后过滤 ,取滤液,再加冰片 ,溶解后分装)。对照药物选用正红花油。

1.3 实验仪器 软组织打击器(自制),Labsystems Multiskan M S352型酶标仪,Thermo Labsystems AC8洗板机,TG16W微量高速离心机,GNP-9080型隔水式恒温培养箱,ELISA Kit for Rat IL-1β(美国 RD公司进口分装 ,生产批号:20100615)

2 实验方法

造模方法参照文献[1]略加改造:SD大白鼠 36只 ,实验前1d禁水禁食,以 8%硫化钠溶液右后肢脱毛。实验前,以 3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,注射剂量:1.5mL/kg,麻醉成功后将大鼠固定在自制打击器上,将 200g重的砝码通过与砝码直径相当的塑料管中自 20cm高处垂直自由落体冲击大鼠大腿外侧肌肉丰厚处,连续打击 2次 ,打击面积约 1cm×2cm,造成打击局部出现散在出血点,皮下瘀肿创面及肿胀的非开放性软组织损伤模型[2]。排除皮肤破损或骨折者,并已经解剖及组织学验证成功率为 100%。

造模成功的大鼠按随机数字表法分为将大鼠随机等分为 3组:模型组,正红花油药物对照组和消肿喷剂药物治疗组。12只未打击大鼠为空白组。模型组、空白组不予给药,对照组与治疗组每天早晚各外拭给药一次,连续给药 5d。各组均给予正常饲食。造模后 1,3,5 d二次给药前,分 3批处死大鼠,以打击部位为中心,沿损伤处切取肌肉组织,备用。

3 观察评分标准 每天二次给药前观察记录 1次,并根据相应标准,给予评分。

3.1 病情程度评估 大鼠损伤局部损伤情况及活动度,并给予评分。评分标准[3]:触痛:触之疼痛反应明显 3分,触之疼痛反应轻 2分,触之无疼痛反应 1分;肿胀:红肿面积 0.5cm2及以上 3分,红肿面积 0～ 0.5 cm22分 ,无红肿 1分。 功能障碍:明显跛行 3分,跛行不明显 2分,无跛行 1分。

3.2 损伤征候评分 观察伤肢瘀斑、肿胀和肌肉颜色等征候表现,并给予评分。评分标准[4]:皮下瘀血:多量块状计 2分,少量点状计 1分,无瘀血者计 0分;肌肉肿胀:明显肿胀计 2分,稍有肿胀计 1分,无肿胀者计 0分;肌肉颜色:紫暗色深计 2分,暗红色浅计 1分,色泽正常计 0分。

3.3 组织形态学观察评分 将取材组织进行石蜡切片,HE染色并在光学显微镜下观察组织学形态,并分级评分[1]:充血出血:血管大片充血计 3分,血管中度充血或灶性出血计 2分,个别血管轻度充血计 1分,血管无充血计 0分。炎症:大量炎细胞弥漫浸润计 3分,较多炎细胞片状浸润计 2分,少数炎细胞散在浸润计 1分,无炎细胞浸润计 0分。变性坏死:组织大片坏死计 3分,组织广泛变性计 2分,局部组织变性计 1分,无变形坏死计 0分。

[(21.6-8.8)×0.65+(0.731-0.26)×317.5] ×270×12=51.15(万元)

3.4 白细胞介素-1β(IL-1β)检测 将取材组织用生理盐水漂洗 1min,滤纸吸干,分析天平称取组织 100mg,按照 5mL/100 mg加入生理盐水,匀浆器中均匀缓慢研磨 15 min,至匀浆液呈均匀悬浊液,倒入试管中,2 500 r/min高速冷冻离心机离心 15min,收集上清液,置于-20℃冰箱中备用。用 ELISA法测定 IL-1 β的含量,具体操作步骤严格按照试剂盒操作说明完成。

4 统计学方法

5 实验结果

5.1 病情程度评估 第 1d各造模组大鼠的病情评分比较,差异无统计学意义;治疗过程中各造模组的病情评分逐渐下降,治疗 3d后和 5d后,同期红花油组、消肿喷剂组的病情评分明显低于对照组组。差异有统计学意义,同一观察时段,红花油组、消肿喷剂组之间差异无统计学意义。各组病情程度评估结果见表 1。

表1 各组大鼠治疗后不同时期病情评分结果(±s)

表1 各组大鼠治疗后不同时期病情评分结果(±s)

组别 第1天 第 3天 第 5天空白组 3.00± 0.00 3.00± 0.00 3.00± 0.00模型组 8.00± 0.90 6.17± 0.76 4.66± 0.59红花油组 8.00± 0.63 4.67± 1.03 3.30± 0.56消肿喷剂组 7.83± 0.75 4.50± 1.02 .00± 0.00

5.2 损伤证候评分 损伤征候指数观察造模后大鼠伤肢迅速出现肿胀、皮肤瘀斑及皮下出血现象,伤势以伤后第 1天最明显,随后渐轻,至第 5天肿胀基本消退,局部或肢体远端残留皮肤瘀斑。

消肿喷剂组和红花油组与模型组比较,伤肢肿胀程度低,消退速度快,在伤后第 3天已见明显消退,瘀斑的消散情况亦优于模型组。损伤证候指数评分损伤后 1d,红花油组与模型组组间无明显差异性(P＞0.05),消肿喷剂组与模型组组间具有明显差异性(P＜0.05),损伤后 3d,5d,消肿喷剂组和红花油组与模型组组间均具有明显差异性(P＜0.01)。各组大鼠治疗后不同时期的损伤证候评分结果见表 2。

表2 各组大鼠治疗后不同时期损伤证候评分(±s)

表2 各组大鼠治疗后不同时期损伤证候评分(±s)

组别 第1d 第3d 第5d空白组 0 0 0模型组 5.67± 0.51 4.83± 0.75 3.00± 0.88红花油组 5.00± 0.62 3.00± 0.88 1.83± 0.75消肿喷剂组 4.17± 0.75 3.00± 0.88 1.00± 0.89

5.3 组织形态学观察评分

治疗后第 3天模型组见肌肉广泛的充血水肿,玻璃样团快状,横纹消失,肌核增生,较多中性白细胞浸润。红花油组与消肿喷剂组充血、水肿减轻,少数肌纤维淡染,肌间质及血管周围可见少量中性细胞浸润。

治疗后第 5 d模型组部分肌纤维红染,少量肌纤维扭曲,排列紊乱,偶见红细胞瘀积现象,白细胞呈弥漫性浸润。红花油组与消肿喷剂组见少量充血水肿,白细胞浸润以及肌浆碎裂不明显,肌纤维形态大致正常。

组织形态学观察评分损伤后各观察时段,模型组与消肿喷剂组和红花油组组间均具有显著差异性(P＜0.05或 P＜0.01)。各组大鼠治疗后不同时期组织形态学观察评分结果见表3。

表3 各组大鼠治疗后不同时期组织形态学观察评分(±s)

表3 各组大鼠治疗后不同时期组织形态学观察评分(±s)

组别 第3天 第 5天空白组 0 0 0模型组 8.66± 0.53 7.17± 0.74 5.56± 1.03红花油组 6.67± 0.53 4.83± 0.76 3.67± 0.81消肿喷剂组 6.67± 0.72 5.67± 0.81 3.33± 0.81

5.4 局部 IL-1β含量

经 3d治疗,空白组与各造模组比较具有显著差异性(P＜0.05);模型组与红花油组、消肿喷剂组比较具有显著差异性(P＜0.05);红花油组、消肿喷剂组之间无统计学意义(P＞0.05)。

经 5d治疗,空白组与模型组比较具有显著差异性(P＜0.05),与红花油组、消肿喷剂组比较差异无统计学意义(P＞0.05);红花油组、消肿喷剂组之间无统计学意义(P＞0.05)。治疗3 d、5 d后局部 IL-1 β 含量见表 4。

表4 治疗 3d、5d后局部 IL-1β含量 (±s)

表4 治疗 3d、5d后局部 IL-1β含量 (±s)

组别 第3d 第5d空白组 7.03± 1.83 8.16± 1.80模型组 17.99± 3.02 13.60± 1.18红花油组 13.08±1.84 8.49±1.77消肿喷剂组 13.24±1.26 8.52±1.91

6 结 果

软组织损伤是由各种致伤因素作用于机体而引起软组织损伤的一系列病理变化的疾病,主要病理表现为损伤局部的炎症反应和炎性介质的释放增加、酸性产物的积聚,使得损伤局部发生微循环障碍,毛细血管破裂、通透性增加,血管张力下降,血流减缓甚至瘀积,继而加重炎症反应。因此,气滞血瘀,筋脉阻滞是急性筋伤的病机,治疗应以活血化瘀之药,直接作用于局部,可使瘀血速去、肿胀疼痛尽快消除。

现代药理学研究表明,抑制无菌性炎性渗出,改善微循环,促进水肿吸收,减轻局部损伤,有利于创伤组织的修复愈合[5,6]。消肿喷剂所含药物苏木可以减少细胞培养上清液中 IL-2的生成[7]。栀子提取物京尼平苷具有较好的治疗软组织损伤的作用[8]。 姜黄素对 IL-8、 M IP-1 α、MCP-1、 IL-1b及 TNF-α有抑制作用。乳香乙醇提取物可抑制大鼠体内的多形核白细胞浸润[9]。诸药合用有明显活血化瘀、消肿止痛作用。

研究结果表明消肿喷剂能够抑制损伤局部 IL-1 β表达 ,且在治疗 3 d,5 d后与模型组比较具有显著差异性,经 5 d治疗后,消肿喷剂组与空白组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。消肿喷剂对损伤局部炎症反应具有抑制作用,从而发挥发挥对急性软组织损伤动物模型有治疗作用。

综合本研究,消肿喷剂可明显改善急性软组织损伤动物模型症状、症候,加速伤肢组织修复,抑制损伤局部炎性细胞因子IL-1 β表达,加速损伤组织修复。但其深入的机理尚有待进一步探讨。

[1] 周国林 ,姚全胜,潘玉英.一种动物软组织损伤的实验方法 [J].中国药理学通报 ,1991,7(5):396-398.

[2] 李卫星,谭大琦,李秋华,等.消瘀止痛膏对大鼠急性软组织损伤的治疗作用 [J].中医正骨,2000,12(11):11.

[3] 苏培基,梁必如.伤科洗方的实验研究 [J].中医正骨,2002,14(12):11-12.

[4] 何朝勇,李 楠,陈丽华,等.奇正消痛贴治疗急性软组织损伤实验研究[J].中医正骨,2008,20(11):9.

[5] 陈迎春 ,高绍芳,邸淑珍.舒筋涂剂治疗急性软组织损伤的实验研究 [J].陕西中医,2009,30(4):490-491.

[6] 张根印,牛淑亮,杨 宁.苏栀消肿膏对急性软组织损伤模型大鼠血液流变学的影响 [J].陕西中医学院学报,2008,31(3):49-50.

[7] 姚全胜,周国林.栀子抗炎、治疗软组织损伤有效部位的筛选研究[J].中国中药杂志,1991,16(8):486-488.

[8] SharmamL,KhajuriaA,KaulA,eta.l Effectof salai guggalBoswellia serrataon cellularand humoral immune responses and leuco-cytemigration[J].Ital JBiochem,1988,24(1-2):161.

[9] 潘鑫鑫,严晴山.人参、西洋参及三七总皂甙对大鼠血小板功能及血栓形成的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志,1993,7(2):14.