痰湿体质与瘦素基因C2549A SNP多态性相关性研究

周 菁，罗海明

(上海中医药大学附属岳阳医院 心内科，上海 200437)

痰湿体质是指因先天遗传，或后天过食肥甘等因素，而至津液运化失司，痰湿凝聚，以黏滞重浊为主要特征的体质状态[1]。该体质人群易患胸痹、消渴等病证，但其患病机制尚未完全明确。之前已有研究[2-4]报道痰湿体质具有遗传特异性，我们前期的研究[5]也发现痰湿体质与低密度脂蛋白受体基因PvuⅡ、AvaⅡ多态性相关,且这种低密度脂蛋白受体基因PvuⅡ、AvaⅡ多态性的差别直接导致痰湿体质人群与平和质人群之间血脂指标的不同。但这项研究距离揭示痰湿体质人群易患胸痹、消渴等病证的本质原因相差甚远。瘦素(Leptin，LEP)是肥胖基因(ob)在脂肪细胞表达的产物。LEP具有抑制食欲、减少脂肪合成、增加肌体耗能等作用，并对肥胖、糖尿病、心血管疾病、生殖系统疾病等产生影响。因此，痰湿体质人群较平和质人群更易患冠心病、Ⅱ型糖尿病等疾病的原因，是否与瘦素基因多态性相关联值得我们进行深入探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部104例研究对象均为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院自2009年1月-2010年12月收治的心血管内科住院病人。按纳入标准，分为痰湿体质组和平和质组[1]。其中痰湿体质组58例，男30例，女28例,平均年龄(58.04±11.39)岁；平和质组46例，男25例，女21例，平均年龄(58.04±11.69)岁。2组间一般情况比较，无统计学意义。

1.2 检测方法

1.2.1 基因组DNA提取及PCR扩增 取ACD抗凝外周血1.0 mL,用北京天根生物提供的全血DNA试剂盒(DP304)提取基因组DNA。PCR扩增瘦素，上游引物：5’-TTTCCTGAATTTTCCCGTGAG -3’；下游引物:5’-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA -3’。PCR循环参数:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s、55 ℃、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸5 min→4 ℃ 保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。

1.2.2 限制性内切酶酶切反应 取PCR产物5 μL加限制性内切酶cfoI 0.5 μL,反应体系20 μL,置37 ℃水浴2 h酶切。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件,计数资料比较用χ2检验。P≤0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘦素基因C2549A SNP多态性基因型检测结果 瘦素LEP2549 C/A的PCR扩增产物长度为242 bp，经限制性内切酶cfoI酶切后，产生3种基因型，即CC型、CA型、AA型。CC型显示242 bp 1条带，CA型显示242 bp、181 bp和61 bp 3条带，AA型显示181 bp和61 bp 2条带(见图1)。

2.2 2组基因型分布 见表1。

表1 2组瘦素LEP2549 C/A基因型分布 例

2.3 2组等位基因频率比较 见表2。

表2 2组瘦素LEP2549 C/A等位基因频率比较

图1 瘦素基因C2549 SNP多态性基因型检测结果

3 讨论

瘦素(LEP)作为一种调节分子,在糖、脂等物质代谢过程中具有重要作用，近年的研究[6]揭示其在代谢性疾病中有重要作用。瘦素与糖尿病之间最直接的联系莫过于瘦素与胰岛素的相互作用。胰岛素不仅作用在脂肪细胞上刺激瘦素分泌，同时也作用在瘦素的靶细胞上限制瘦素的功能，它可能是糖尿病发病早期代偿性高胰岛素血症和“瘦素抵抗”相伴发的原因之一。瘦素与胰岛素抵抗密切相关,胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的重要致病因素之一。鉴于瘦素基因的生物活性及其基因多态性特点,可能瘦素基因是Ⅱ型糖尿病的候选基因之一。

此外，瘦素与血脂代谢异常及冠心病密切相关。大量研究[7]表明，瘦素促进泡沫细胞的形成除了增加清道夫受体外,还与以下病理过程有关：1)瘦素增加巨噬细胞酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1的表达，促进巨噬细胞内胆固醇酯的蓄积，加速泡沫细胞的形成，导致动脉粥样硬化的发生发展[8]。2)瘦素增加3-羟基-3·甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，从而增加单核细胞中内源性胆固醇的合成，有助于泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块的形成[9]。3)瘦素激活磷脂酰肌醇-3激酶使巨噬细胞活化后，不仅使细胞内脂肪组织分化相关蛋白表达增加，而且使细胞质中富含脂肪组织分化相关蛋白的脂滴形成增加。细胞内脂肪组织分化相关蛋白表达的增加，将促进中性脂肪如三酰甘油和胆固醇在细胞内的沉积而减少它们的流出，增加脂滴对脂解作用的稳定性[10]。这些病理过程均有助于泡沫细胞的形成，加速动脉粥样硬化的发生发展。因此瘦素与动脉粥样硬化以及冠心病的发生息息相关。且研究[11]发现瘦素基因A-2549C多态性与个体空腹血浆瘦素水平相关。因此，瘦素基因多态性可能也是导致冠心病的原因之一。

因瘦素基因多态性与糖尿病/冠心病等疾病的发生密切相关,而痰湿体质人群较平和质人群更易患糖尿病/冠心病等疾病，因此,痰湿体质是否与瘦素基因多态性相关吸引着我们的关注。

本课题研究发现，瘦素LEP2549 C等位基因频率痰湿体质组高于平和质组，但2组间统计无统计学意义(P>0.05)。该结果提示，痰湿体质与瘦素基因2549C/A SNP多态性有某种程度的相关，但依据目前结果暂不能将该基因多态性作为区分2种体质人群的遗传标志物，2种体质人群间的差异性仍需我们扩大样本量再进行深入研究。

[1]王琦.中医体质学[M].北京:中国医药科技出版社,1995:96-195.

[2]骆斌,黄山.肥胖人痰湿体质与人类白细胞抗原关联研究[J].北京中医学院学报,1993,16(5):9-11.

[3]高洁,吕凤娟,林蒋海.中医痰湿体质与HLA-类基因相关性研究[J].陕西中医,2007,28(5):622-625.

[4]王琦,龚海洋,高京宏.肥胖人痰湿体质外周血基因表达谱特征研究[J].中医杂志,2006,47(11):851-854.

[5]Zhou jing,Luo haiming.Exploration of the Relationship between Phlegm-Dampness Constitution and Polymorphism of Low Density Lipoprotein Receptor Genes PvuII and AvaII[J].Chin J Inter Med 2007,13(3):170-174.

[6]Wauters M,Considine RV,Yudkin J S,et a1.Leptin levels in type 2 diabetes:associations with measures of insulin resistance andinsulin secretion[J].Horm Metab Res 2003,35(2):92-96.

[7]Kjerrulf M,Berke Z,Aspegren A,et al.Reduced cholesterol accumulation by leptin deficient(ob/ob)mouse macrophages[J].Inflamm Res 2006,55(7):300-309.

[8]Bai Z,Cheng B,Yu Q,et al.Effects of leptin on expression of acyl-coenzymea:cholesterol acyltransferases-1 in cultured human monocyte-macrophages[J].J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci,2004,24(6):563-565,590.

[9]Kosztaczky B,Foris G,Paragh G Jr,et al.Leptin stimulates endogenous cholesterol synthesis in human monocytes: new role of an old player in atherosclerotic plaque formation.Leptin-induced increase in cholesterol synthesis[J].Int J Biochem Cell Boil,2007,39(9):1637-1645.

[10]Maya-Monteiro CM,Almeida PE,D Avila H,et al.Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism[J].J Biol Chem.,2008,283(4):2203-2210.

[11]任伟,张素华,吴静,等.105例正常人瘦素基因多态性与血浆瘦素水平关系的研究[J].重庆医学.2004,33(9):1341-1344.