木兰花碱对HERG钾通道蛋白表达的影响

(青海大学医学院生物化学教研室，西宁 810001)

心律失常为人类猝死的主要原因，其发生、发展与心肌细胞膜上的离子电流改变密切相关，心肌细胞膜上的离子通道为心律失常发生的重要靶点和抗心律失常药物的作用靶点［1］。HERG(human ether a go-go related gene)编码心肌快速激活的延迟整流钾通道(IKr)的α亚基，在心肌细胞的复极化过程中发挥重要作用，既是抗心律失常药物作用的重要靶点，也是产生致死性心律失常的分子靶点［2］。木兰花碱(又名木兰碱，别名唐松草碱)是毛茛科植物粗果唐松草的根街植物中主要的活性物质，具有抗炎、降压、抑制肿瘤细胞生长及抗心律失常等作用［3，4］，但其对HERG钾通道蛋白(以下简称HERG蛋白)表达的影响鲜见报道。2010年12月～2011年6月，我们观察了不同浓度木兰花碱对HERG蛋白表达的影响，旨在探讨木兰花碱抗心律失常的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞:HEK-293细胞株(中国协和医科大学)，稳定转染 HERG基因重组载体的HEK-293细胞(中国科学院上海生命科学研究所)。药品与试剂:胎牛血清(上海华壹生物科技有限公司);DMEM培养基(上海沪峰生物科技有限公司，含10% 胎牛血清和400 μmol/L G418);抗HERG的多克隆兔抗体(1∶200，北京博奥森生物技术有限公司);木兰花碱标准品(中国药品生物制品检定所，实验前用PBS溶解，过0.22 μm微孔滤膜，无血清培养基稀释，使终浓度分别为 1、3、10、30 μmol/L;1、3 μmol/L 为低浓度，10、30 μmol/L 为高浓度。

1.2 细胞培养及 HERG蛋白测定 将 HERGHEK-293细胞培养于DMEM培养基中，HEK-293细胞培养于上述不含G418的培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度孵育培养箱培养，消化传代，取对数生长期细胞采用Western blot蛋白印迹法测定HERG蛋白表达。结果证实HEK-293细胞中没有HERG蛋白表达;而HERG-HEK-293细胞中存在HERG蛋白表达，共发现两条带，一条带的相对分子质量约为155 kD，另一条带的相对分子质量在135 kD附近，见图1A。

1.3 细胞干预及HERG蛋白测定 ①蛋白印迹法:将对数生长期HERG-HEK细胞分别以空白培养基和含木兰花碱1、3、10、30 μmol/L的培养基中孵育24 h，PBS收集细胞并提取总蛋白，用Bradford法行蛋白定量。测定HERG蛋白表达:取等量样品，加入等体积上样缓冲液，煮样、电泳、转膜、封闭［5］，加入一抗(1∶2 00)，室温孵育2 h，用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10 min，用红外荧光标记的羊抗兔二抗(1∶4 000)避光孵育1 h，用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15 min，再用PBS缓冲液洗膜10 min。用图像分析软件Scion Image计算光密度积分值。②免疫荧光法:将对数生长期HERG-HEK细胞稀释至铺有盖玻片的6孔板中培养。待细胞爬片贴壁后，分别以空白培养基和木兰花碱 1、3、10、30 μmol/L的无血清培养基孵育24 h。依次进行固定、穿透、封闭［5］，一抗(1∶200)4 ℃孵育过夜，用 PBS冲洗 3次，每次 5 min，加入荧光标记的羊抗兔抗体(1∶200)，室温避光反应2 h。用PBS冲洗3次后利用激光共聚焦显微镜观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。计量数据以±s表示，采用Students't检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白印迹法 低浓度木兰花碱不影响HERG蛋白的表达(P＞0.05)，高浓度的木兰花碱显著抑制 HERG 蛋白，P ＜0.01。1、3、10、30 μmol/L 的木兰花碱作用后HERG蛋白表达的光密度积分值分别为 1.01、1.03、0.71 和 0.69。高浓度与低浓度比较，P ＜0.01。

2.2 免疫荧光法 显微镜观察发现，低浓度木兰花碱荧光强度与对照组相比并无明显变化，随木兰花碱浓度升高，细胞膜上的荧光强度逐渐减弱，与蛋白印迹法结果一致。

3 讨论

HERG蛋白属于N连接糖蛋白，研究发现其细胞外部分存在两个糖基化的位点(N598，N629)，N连接糖基化与HERG通道的稳定性有密切关系，控制蛋白质的折叠、运输、修饰、以及使其免受蛋白酶的降解［6］。HERG蛋白在转运至细胞膜前，需要在内质网中合成，经高尔基复合体的修饰加工，在这个过程中，发生错误的折叠或装配不完全的蛋白会在内质网中被质量控制识别并使其潴留在内质网中被降解，其中质量控制机制包括伴侣蛋白控制和蛋白酶降解，均可以影响成熟蛋白的表达。近年来发现，HERG钾通道在心律失常的发生与治疗中起双重作用，HERG缺陷可引起先天性QT间期延长综合征(LQTS)，同时某些药物通过阻断钙通道，抑制HERG蛋白表达，可引起获得性LQTS，甚至引起猝死［7，8］。即HERG钾通道不仅是抗心律失常药物作用的一个重要靶点［1］，也是产生致命性心律失常的分子靶位。因此对HERG钾通道的研究将有助于开发更安全、更高效的抗心律失常药物。

木兰花碱属于双苄基异喹啉类生物碱，具有良好的抗心律失常作用［2］。但其具体的分子机制及细胞生物学机制并未完全阐明。本研究采用针对N末端的HERG通道蛋白抗体作为一抗，蛋白印迹法发现HERG-HEK-293细胞存在两条带，其中相对分子质量为155 kD的蛋白为HERG通道完全糖基化形式，即该通道的成熟形式，主要定位于细胞膜上;而相对分子质量为135 kD的蛋白为HERG通道核心糖基化的形式，即成熟通道的前体，主要存在于内质网和高尔基复合体中［9］。高浓度木兰花碱作用后HERG蛋白表达明显受抑。

本研究证实，高浓度木兰花碱可明显抑制HERG蛋白表达，此可能为其抗心律失常的分子机制。本研究为木兰花碱的安全性应用提供了理论支持。

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