非小细胞肺癌患者瘦素、OB-Rb、VEGF的表达及其临床意义

孙雷雷，车淑玉，于洪升，蒋捍东

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003)

瘦素是肥胖基因编码的蛋白产物，其可通过特异性激活瘦素受体(OB-Rb)，参与调节能量平衡、生殖、免疫及代谢等多种生理过程。近年研究表明，瘦素和OB-Rb(b型)与肿瘤的发生、发展密切相关，其可能参与肿瘤血管生成。血管内皮生长因子(VEGF)作为重要的正向调节因子参与微血管生成。为探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者瘦素、OBRb、VEGF表达及其临床意义，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2004年4月～2005年7月在我院胸外科经手术和病理证实的NSCLC患者30例，男17例、女13例，年龄47～73岁、中位年龄59岁。其中鳞癌13例，腺癌17例;肺癌TNM分期Ⅰ期12例，Ⅱ期8例，Ⅲ期10例;有、无淋巴结转移者分别为11、19例。均无糖尿病及其他代谢性疾病，未行放、化疗。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 将患者手术切除的石蜡切片标本常规脱蜡、水化后，置枸橼酸缓冲液中经微波修复抗原，采用PV-6000二步法、免疫组化染色试剂盒说明书检测NSCLC组织及其癌旁正常组织的瘦素、OB-Rb和VEGF。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，脂肪组织的染色结果为阳性对照。瘦素兔抗人多克隆抗体、OB-Rb羊抗人多克隆抗体(工作浓度1∶50)购自北京中杉金桥生物公司。

1.2.2 瘦素、OB-Rb和VEGF表达判定 每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为阳性表达数。阳性细胞染色以细胞质为主，可见棕黄色颗粒。参照文献［1］制定免疫组化半定量标准，先对染色强度记分:0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;再对阳性细胞所占百分比记分:0分为无着色细胞，1分为阳性细胞＜10%，2分为阳性细胞10% ～50%，3分为阳性细胞51% ～75%，4分为阳性细胞＞75%。染色强度与阳性细胞百分比乘积＞3分为免疫反应阳性，≤3分为阴性。

1.2.3 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件，瘦素、OB-Rb、VEGF表达及其与临床病理参数的关系用χ2检验、Fisher精确检验，相关分析用 Spearman相关性分析;用Cox回归模型进行多因素预后分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘦素、OB-Rb、VEGF 在 NSCLC、癌旁正常组织中的表达 在NSCLC、癌旁正常组织中，瘦素阳性表达位于细胞质，可见棕黄(褐)色染色，瘦素阳性者分别为21(70.0%)、6 例(20.0%)，两者阳性率比较P＜0.05;OB-Rb阳性表达主要位于细胞质，部分表达在细胞膜，可见棕黄(褐)色染色，OB-Rb阳性者分别为22(73.3%)、13 例(43.3%)，两者阳性率比较P＜0.05;VEGF阳性表达主要位于细胞质，细胞膜呈弥散或局灶分布，可见棕黄(褐)色染色，VEGF 阳性者分别为28(93.3%)、8 例(26.7%)，两者阳性率比较P＜0.05。

2.2 瘦素、OB-Rb、VEGF表达与NSCLC临床病理特征的关系 Fisher精确检验显示，在NSCLC组织中，瘦素、OB-Rb、VEGF表达与其病理类型、淋巴结转移及TNM分期均无相关性(P均＞0.05)。

2.3 相关性分析 Spearman相关性分析显示，NSCLC组织中的瘦素与OB-Rb、OB-Rb及VEGF表达均呈正相关(r分别为 0.428、0.443，P 均 ＜0.05)。

2.4 瘦素、OB-Rb表达与NSCLC预后的关系 术后随访6～60个月，NSCLC患者的5 a生存率为43.3%，其中瘦素阴性、阳性患者分别为77.8%、33.3%，瘦素阳性患者的生存率明显低于阴性患者(P＜0.05);OB-Rb阴性、阳性患者分别为62.5%、40.9%，OB-Rb阳性患者的生存率低于阴性患者(P＜0.05)。多因素Cox回归分析显示，TNM分期、瘦素是影响NSCLC预后的独立风险因素(P＜0.05)，OB-Rb、VEGF表达与其预后无相关性(P＞0.05)。

3 讨论

1994年，Zhang等［2］成功克隆了小鼠的肥胖基因及人类同源序列，阐明了肥胖基因蛋白产物瘦素的分子结构和生理作用。Stavros等［3］研究发现，瘦素在体内有促血管形成作用;瘦素与瘦素中和抗体结合后，其促血管生成作用消失。Ponnandai等［4］提出，瘦素还有促肿瘤生长的作用。瘦素发挥作用需通过OB-Rb，OB-Rb属Ⅰ类细胞因子家族，广泛分布于中枢和外周组织。1999年，Takahumi等［5］采用RT-PCR检测发现肺组织中存在OB-Rb b型。OBRb不含内源性酪氨酸激酶结构域，其通过JAK/信号转导及转录活化因子(STAT)途径转导发挥作用［6］。JAK/STAT途径是多种细胞因子和生长因子与其相应受体结合后，激活JAK等酪氨酸激酶，使STAT磷酸化;然后形成二聚体转位至细胞核中，与DNA上的靶基因结合，激活靶基因转录。Hakansson-Ovesjo等［7］研究发现，瘦素缺陷小鼠的STAT蛋白表达下调。近年研究证明［8］，瘦素和OB-Rb在宫颈癌、结直肠癌、NSCLC等恶性肿瘤组织中表达，提示二者与肿瘤的发生、发展密切相关。另有研究证实，血管生成在肿瘤的生长、转移中起重要作用，诱导血管生成可促进肿瘤生长和转移，当肿瘤生长至2 mm3时，如缺乏新生血管提供营养，则肿瘤细胞停止增殖。Enzo等［9］提出，VEGF作为重要的正向调节因子，参与NSCLC的微血管生成，在其发生、发展和转移中起重要作用。Niu等［10］用染色质免疫沉淀法发现，STAT3蛋白在体内结合于VEGF启动子后，VEGF启动子上的STAT3蛋白结合位点发生突变，可致后者介导的VEGF活性消失;体内STAT3蛋白活性增强可上调VEGF表达，促进血管生成;反之，可阻断STAT3蛋白信号传导，下调VEGF表达。胥文春等通过免疫组化检测证实，NSCLC组织中的STAT3蛋白与VEGF阳性表达呈显著正相关。由此推断，瘦素通过JAK/STAT途径上调VEGF表达，后者促进肿瘤血管生成，在NSCLC的发生、发展和转移中发挥作用。

本研究发现，NSCLC组织中瘦素、OB-Rb、VEGF的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，提示三者在NSCLC组织中呈异质性高表达，且在肺癌发生过程中有活跃的血管增殖;并发现瘦素与OB-Rb、OB-Rb与VEGF有相关性，证实瘦素与OB-Rb结合后可能通过信号转导上调VEGF表达，通过VEGF高表达促进NSCLC组织中的血管生成。本研究还显示，NSCLC组织中的瘦素、OB-Rb、VEGF表达与患者的性别、病理类型、淋巴结转移和TNM分期均无明显关系，提示检测NSCLC组织中的瘦素、OB-Rb表达对判断其恶性程度及病情转归无明显价值。本研究随访显示，NSCLC患者的5 a生存率为43.3%，TNM分期和瘦素阳性是影响其预后的独立因素，提示对NSCLC患者行瘦素检测有助于评估其预后。

［1］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症杂志，1996，6(4):229-231.

［2］Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994，372(6505):425-432.

［3］Stavros A，Anastasios J，Lambropoulou M，et al.Human leptin induces angiogenesis in vivo［J］.Cytokine，2008，42(3):353-357.

［4］Ponnandai S，David W，Stanley M，et al.Leptin is a growth factor in cancer［J］.Journal of Surgical Research，2004，116(2):337-349.

［5］Takahumi T，Hiroyuki S，Takeo H，et al.Expression of leptin receptor in lung:leptin as a growth factor［J］.European Journal of Pharmacology，1999，365(2-3):273-279.

［6］Gary S.Leptin signalling［J］.Cellular Signalling，2002，14(8):655-663.

［7］Hakansson-Ovesjo ML，Collin M，Meister B.Down-regulated STAT3 messenger ribonucleic acid and STAT3 protein in the hypothalamic arcuate nucleus of the obese leptin-deficient mouse［J］.Endocrinology，2000，141(11):3946-3955.

［8］刘晖，徐渭贤，曹丽静，等.结直肠癌中瘦素的表达及其在血管生成中的关系［J］.山东医药，2009，49(36):45-46.

［9］Enzo G，Antonella F.Angiogenesis and aitiangiogenic agents in non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2001，34(4):3-7.

［10］Niu G，Wrighr KL，Huang M，et al.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesin［J］.Oncogene，2002，21(13):2000-2008.