不同采收期黄芩HPLC指纹图谱比较研究

杨亚丽 吴 芳 杨瑞瑞 陕西省食品药品检验所 (西安 710061)

黄芩为唇形科植物黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 ,性苦寒,归肺、胆、脾、大肠、小肠经。有清热燥湿,泻火解毒,止血安胎之功效。用于湿温、暑湿,胸闷呕恶,湿热痞满,泻痢,黄疸,肺热咳嗽,高热烦渴,痈肿疮毒等症,是我国中医临床常用大宗药材品种之一。黄芩含有多种化学成分,目前从黄芩中提取并鉴定出结构的黄酮类成分已有十几种,含量较高的成分有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素。黄芩主产区为我国的西北地区、华北地区、东北地区。就品质上而言,种源为山东和陕西的药材综合指标较高。 2010版《中国药典》规定黄芩采收期为春秋二季,但不同采收期对黄芩药材化学成分及其质量有无影响,目前尚无报道。我们对收集到陕西产的 20批样品,以黄芩苷为指标,建立了陕西省不同采收期黄芩的标准指纹图谱,为黄芩药材全面质量控制提供可靠的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters-Alliance2695-2487(G02SMT649M)高效液相色谱仪。

1.2 试药 水为超纯水,乙腈、甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯。黄芩苷,批号 110736-200423)中国药品生物制品检定所提供。黄芩样品采自陕西省不同地区,共 20批,其中 1～10批为春季采收,11～20批为秋季采收。经陕西中医学院王继涛教授鉴定为唇形科植物黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 选用 SUPELCO DiscoveryC18柱(250mm×4.6mm,5 μ m);乙腈 (A)20.25% 磷酸(B)-四氢呋喃(C)为流动相进行梯度洗脱:0～14 m in(21%A-78%B-1%C),17 m in(28%A-71%B-1% C),25 m in(31% A-68% B-1% C),45～60 m in(39% A-60%B-1% C),65 m in(30% A-69%B-1%C),70 m in(21%A-78%B-1%C)。检测波长 274 nm;体积流量 1.0 mL/m in;柱温 30℃;进样量 10 uL;理论板数按黄芩苷峰计算应约为 2×105,与其他峰的分离度均大于 1.0。所有组分均在 70 m in内被检测完。

2.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并稀释制成 0.1m g/mL的溶液,作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取黄芩药材粉末(过 5号筛)0.2 g,精密称定,置 100 m L量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,称定重量,超声提取 45 m in,取出,放冷,用甲醇补足重量,摇匀,滤过,取续滤液 2 mL置5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜(0.45um)滤过,即得供试液。

测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 μL,注入液相色谱仪。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验:精密吸取同一份样品溶液(No.10)10 μL,连续进样 5次,计录 HPLC色谱图。测得供试品溶液各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于 3%,表明精密度良好。

2.4.2 重复性试验:取同一批样品(No.10)6份,按 2.3项方法制备供试品溶液,分别进样 10 μL,计录HPLC色谱图。测得供试品溶液各共有峰相对峰面积和相对保留时间的 RSD均小于 3%,表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验:精密吸取同一份黄芩(No.10)供试品溶液,分别在 0,2,4,6,8,10,12,24h进样10 μL,计录 HPLC色谱图。测得供试品溶液各共有峰相对峰面积和相对保留时间比值无明显变化,RSD均小于 3%,表明供试品溶液在 24h内稳定。稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱的制备:取春秋季采收的黄芩样品各 10批,按 2.3项方法制备供试品溶液,分别进样10 μL,计录 HPLC色谱图。将药材指纹图谱导入中药色谱相似度评价系统软件(2004 A版),设定匹配模板,进行谱峰自动匹配,并生成对照指纹图谱,结果见图 3～6。 20批样品共有峰相对保留时间、相对峰面积范围分别见表1、表2。

2.5.2 共有峰的确定:10批春季样品生成的对照指纹图谱,有 11个共有峰;10批秋季样品生成的对照指纹图谱,有 14个共有峰;通过与对照品对照,分别指认春季 8号峰,秋季 11号峰为黄芩主要指标成分黄芩苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价:分别采用 SPSS软件的相关系数法、夹角余弦法以及国家药典委员会中药色谱相似度评价系统软件(2004 A版),对不同采收期黄芩样品进行相似度计算,计算所有样品的相似度。结果不同方法所得相似度结果趋于一致,秋季采收的黄芩样品相似度明显高于春季采收的样品,说明不同采收期的黄芩药材所含化学成分有一定的差异。

3 讨 论 3.1 在流动相系统的选择中,分别以乙腈-水、乙腈-0.25% 磷酸、甲醇-水、乙腈-0.25%磷酸-四氢呋喃作为流动相,结果用乙腈-0.25% 磷酸-四氢呋喃梯度洗脱,分离效果最佳。用不同的检测波长检测分析,274nm处指纹峰较多,响应值均较大,且基线较平稳,有利于指纹图谱的分析。故选择 274nm作为检测波长。

3.2 本实验比较了不同提取溶剂如 70%乙醇、50%甲醇、甲醇的不同提取方法的提取效果,以甲醇提取的总体效果为佳。采用甲醇提取,可将其不同成分完全表述。70% 乙醇虽可将黄芩苷提取更完全,但指纹图谱只倾向于某几个峰,甲醇提取黄芩苷的峰相对低些,但就指纹图谱的整体性而言更合适一些。同时还考察了以甲醇为提取溶剂,不同提取时间(30、45、60 m in)的提取效果。结果表明,以甲醇为提取溶剂,超声提取 45 m in,提取较完全,且方法稳定、重现性好。

3.3 本实验用不同的数据处理方法对数据进行分析,由得出的相似度结果可知,20个样本间有较好的相关性,但又有区别。

3.4 秋季采收的黄芩样品相似度明显高于春季采收的样品,说明不同采收期的黄芩药材所含化学成分有一定的差异。通过指纹图谱对不同采收期黄芩药材进行综合宏观分析,有利于全面控制药材质量,促进黄芩药材及其制剂质量控制的全面提高。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一)部.[M].北京:化学工业出版社.2005,211.

[2]Technical Requirement ofthe Fing erprint in Injection of Chinese Materia Medica(Tentative Standard)[中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)][S].2001.

[3]Zhang K R,Bi K S1Study on fingerprint of Rad ix Paeoniae Rubra by HPLC[J]1 Chin Trad it Herb Drugs(中草药),2003,34(11):1048-1051.