土壤微生物群落表征中磷脂脂肪酸（PLFA）方法研究进展

张瑞娟 ，李 华 ，林勤保 ，张 强 ，郜春花

（1.山西大学环境与资源学院，山西太原030006；2.山西大学应用化学研究所，山西太原030006；3.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西太原030006）

土壤微生物（edaphon）是整个微生物界的重要成员。土壤具备微生物生存的基本条件，即营养物质（有机质、无机盐、水分等）、自然环境（温度恒定，中性环境）、生存空间（有氧或无氧），这些使得土壤成为微生物活动最适宜的场所，所以土壤素有微生物的“天然培养基”之称。土壤中的微生物较水体和大气中的数量要大，种类要多，因而土壤被称为“微生物的大本营”[1]。

土壤微生物是土壤的重要组成部分，它对土壤肥力的形成和转化起着积极作用[2-5]。土壤微生物群落是土壤生物区系中最重要的功能成分，土壤微生物本身不仅是土壤养分重要的来源，支撑着土壤肥力，还对其所生存的微环境十分敏感，能对土壤生态机制变化和环境胁迫做出反应，导致群落结构发生变化。所以，土壤微生物群落被认为是土壤生态系统变化的预警及敏感指标，指示土壤质量变化。

土壤微生物生态学研究的蓬勃发展很大程度上归功于其研究方法的改进[6]。随着分子生物学的发展，用于评价土壤微生物群落结构的新方法主要有Biolog法、磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA）法、DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法等。郑华等[7]对 Biolog法在土壤微生物群落功能多样性研究中的应用进行了综述。Xue等[8]用 Biolog，DGGE，PLFA 方法对不同利用方式（荒地、森林、茶园）的土壤微生物群落结构做了对比研究。Zaady等[9]结合PLFA，DGGE，物理及生物生理的方法对3种干旱水平（半干旱、干旱、过度干旱）的生物土壤结皮结构的微生物量及多样性进行调查研究，结果表明，半干旱地区革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）的生物标记物明显高于过度干旱地区，不同干旱水平下生物土壤结皮的不同可以作为评价全球气候变化的依据。王曙光等[10]对Biolog法、PLFA法、DGGE法进行了阐述和比较，认为这3种方法均能针对土壤微生物特性、微生物群落结构和功能变化及差异进行独立分析。

本文重点对PLFA法研究进展作一介绍。

1 土壤中磷脂脂肪酸（PLFA）简介

磷脂几乎是所有微生物细胞膜的重要组成成分，含量在自然生理条件下相对稳定，约占细胞干质量的5%，只存在于活体细胞膜中，一旦生物细胞死亡，磷脂类化合物会迅速降解[11]。由于不同种类微生物体内含有的磷脂脂肪酸（PLFA）的组成及含量差异显著，一些脂肪酸可能只存在于某类微生物的细胞膜中，如：脂肪酸15∶0，i15∶0，a15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用来表征细菌[11-12]；cy17∶0，cy19∶0 指示厌氧菌[11，13]；16∶0，18∶2ω6 等用来指示真菌；15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用来指示放线菌[11]；10Me16∶0，i15∶0，a15∶0，i16∶0，i17∶0，a17∶0 等表征革兰氏阳性菌 （G+）；16∶1ω5c，16∶1ω7t，16∶1ω9c，18∶1ω5c，18∶1ω7c，cy17∶0，cy19∶0等可指示革兰氏阴性菌（G-）[12]。所以，PLFA可以作为微生物生物量和群落结构变化的特征微生物标记物[13]，且适合于微生物群落的动态监测[14]。

2 PLFA方法介绍

2.1 土壤的预处理

Stenberg等[15]比较了土样在（2±2）℃和（-20±2）℃下保存 1，3，6，13 个月对土壤微生物量的影响，研究结果显示，土样在-20℃下保存13个月的测定结果与鲜土的分析结果几乎相同。该结果为我们在野外进行大批量采样而无法及时完成分析测试工作，需经过冷冻保存过程提供了理论依据。

吴愉萍等[16-17]研究了不同土壤质量、土壤含水量、保存条件（鲜土和-70℃下冷冻干燥1 a的土壤）及提取方法（单个提取和连续提取）对PLFA方法的影响，结果表明，随着土壤质量的增加，检测到的PLFA越多，这就要求对于同一组试验要保持土壤质量的恒定；调节土壤含水量没有对PLFA的谱图产生显著影响；自制柱与商品柱（SPE柱）得到的结果几乎相同；经冷冻干燥保存的土壤PLFA总量显著下降，PLFA谱图也发生了变化，因此，最好尽早对采集到的土样进行PLFA分析。

刘岳燕[18]研究了淹育水稻土壤预处理与保存方法（淹育、淹育晾干、淹育冷冻、淹育晾干冷冻、淹育晾干冷藏）对土壤微生物多样性的影响，结果证实，淹育水稻土的预处理和不同保存方法影响微生物群落结构，通过进一步分析发现，淹育冷冻处理的土壤微生物多样性与淹育对照处理的结果更接近，表明淹育冷冻处理对淹育土壤微生物结构多样性的影响较小。

Ĉernohlávková 等[19]研究了不同的保存温度（4℃冷藏、-20℃冷冻、自然风干）和保存时间（2，4，8，16，32 周） 对土壤微生物生物量碳的影响，结果表明，保存时间超过4周，微生物生物量碳会发生显著变化；-20℃冷冻保存8～16周，微生物生物量碳含量显著降低；自然风干保存8周之后微生物量碳也显著降低；4℃冷藏保存产生的影响最小，但并未对土壤微生物群落结构的变化作出评价。

刘艳青等[20]研究了新鲜和冻干土样对河滨缓冲带土壤微生物群落结构的影响，结果表明，用冻干土测定的微生物群落结构分布与用新鲜土测定的结果密切相关（r＝0.972，P＜0.000 1），但冻干土测定的PLFA总量的变异系数小于新鲜土样，且用冻干土测得的PLFA总量、种类和样品分析过程中加入的内标回收率均大于新鲜土样，最终得出利用PLFA法分析土壤微生物群落结构时采用冻干土样更加适合。

有很多学者对土样的保存条件做了研究，但其结果不统一，甚至相反。Stenberg等[15]对造成这种结果的原因进行了探讨，得出3个主要原因：一是微生物对特定的环境有适应能力，而自然条件不恒定；二是采样时微生物的生长状态不一，生长旺盛的细胞对冷冻或冷藏更为敏感；三是外界条件与微生物自身生长环境的差异幅度大小可能对微生物量产生影响。

2.2 PLFA的提取方法

常用的PLFA提取方法有2种[21]，一种是PLFA（Phospholipid Fatty Acid）法，另一种叫 EL提取法（Ester-Linked Extraction Method），也叫TSFAME（TotalSoilFattyAcidMethylEsters）法。2 种方法的主要区别[22]：前者分析的PLFA仅来自活体细胞膜，可了解土壤微生物群落的即时状态；后者分析的PLFA部分来自土壤稳定有机质（土壤腐殖质、根系），反映土壤微生物代谢史。MIDI法是21世纪初新兴起的一种直接提取脂肪酸的方法，最先应用于细菌纯培养的分离鉴定，后推广到土壤领域。

2.2.1 Phospholipid Fatty Acid（PLFA）法 此方法由Bligh等[23]于1959年创建，采用提取剂氯仿∶甲醇∶水，提取冻鱼中的脂质物质，方法简便、快速，但此方法当时仅限于食品，特别是鱼类的磷脂提取。随着现代研究领域的拓宽，该方法也被用于诸如土壤等其他方面，但前提是必须保证氯仿∶甲醇∶水的体积比为1∶2∶0.8。20世纪70年代末，White等[24]将提取剂改为氯仿∶甲醇∶磷酸盐缓冲液（体积比为1∶2∶0.8），对江河、海洋沉积物中的微生物区系进行分析研究，并指出氯仿∶甲醇∶水的体积可以改变，只要满足在单一相萃取中体积比为1∶2∶0.8，在第2阶段分离时维持在1∶1∶0.9即可。20世纪90年代初，Frostegård 等[25]认为，用酸性柠檬酸代替中性磷酸盐缓冲液提取酸性高的有机质土壤，可提高磷脂回收率且避免无机磷污染。

PLFA法通用的步骤概括为 3步[26-28]：（1）提取（提取剂为氯仿∶甲醇∶柠檬酸缓冲液＝1∶2∶0.8，取上清液，提取2次，合并上清液，加柠檬酸缓冲液和氯仿，使氯仿∶甲醇∶柠檬酸缓冲液＝1∶1∶0.9，下层液（氯仿相）中包含磷脂）；（2）分离（固相萃取柱，洗脱剂为氯仿、丙酮、甲醇，收集甲醇相）；（3）甲酯化（甲醇∶甲苯混合液（体积比为1∶1），KOH甲醇溶液（新鲜配制），水浴）。

2.2.2 EL提取法 该方法由 Schutter等[29]于2000年提出，也叫温和碱性甲酯化法。具体步骤为：将15 mL的0.2 mol/L的KOH甲醇溶液和3 g的新鲜土样加到35 mL的玻璃离心管中，混合均匀，在37℃下温育1 h（脂肪酸释放，并甲酯化，样品10 min涡旋1次）。培养结束后，加入3 mL 1.0 mol/L的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀。随后加入10 mL正己烷，480 r/min离心10 min，使磷脂脂肪酸（PLFA）转移到有机相中，将上层正己烷转至干净试管中，在氮气流下吹干溶剂。将磷脂脂肪酸（PLFA）溶解在0.5 mL体积比为1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液中。

2.2.3 MIDI提取法（MIDI Extraction Method）[29-30]

该方法操作简单，提取的脂肪酸来自土壤微生物、土壤腐殖质和植物根系。该方法分4步进行：（1）皂化（NaOH 甲醇溶液，水浴）；（2）甲酯化（HCl∶甲醇（1∶0.85），水浴）；（3）提取（体积比为1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液）；（4）洗涤（NaOH溶液）。与EL提取法相比，该方法多了洗涤步骤。

2.3 PLFA的鉴定方法

2.3.1 液相色谱质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-MassSpectrometry，HPLCMS）[22，31-33]HPLC-MS可分析完整磷脂种类（极性头部）与脂肪酸侧链（非极性尾部），能展示最初活体细胞膜磷脂分子所承载的全部信息。液质联用的缺陷是一般没有商品化的谱库对比查询，只能自己建库或自己分析谱图。目前，HPLC-MS在环境领域主要应用于有标准物质参照下的定性分析。该方法多用于食品方面，土壤方面应用较少。

2.3.2 Sherlock MIS4.5系统（Sherlock Microbial Identification System）[34-38]美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的Sherlock MIS4.5系统，含有碳原子数在8～20（C8-C20）的116种脂肪酸谱图库。MIDI公司已经将PLFA技术商品化，常见的微生物PLFA谱图基本上都包括在其数据库内，仪器要求也由GC-MS降低为GC[39]。

2.3.3 气相色谱质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[9，40-43]GC-MS以气相色谱作为进样系统，质谱为检测器，灵敏度较高，且可获得更低的检出限，分析效率也高，可同时做到定性与定量分析。不仅可识别那些不包括在MIDI系统中的脂肪酸，还可排除被MIDI系统错误识别的非酯成分；不仅可分析C8-C20的脂肪酸，并且可检测到大于C30的脂肪酸。

目前，GC-MS和Sherlock MIS4.5系统在土壤微生物群落研究中被广泛应用[44]。

3 PLFA方法的优缺点

与传统的基于培养基的微生物分离技术及生理学、分析生物学方法相比，PLFA方法具有一定的优越性[44-47]，具体表现在：（1）不需要分离和培养技术，即可获得微生物群落信息，适合微生物群落的动态追踪；（2）减少分离和培养过程中的人为误差，更为快速、简便、精确；（3）试验条件要求较低，结果较为客观、可靠；（4）能定量描述环境样品中的微生物群体；（5）最适合用作微生物群落的总体分析，而不是专一的微生物种类的研究。

虽然PLFA方法在分析土壤微生物群落结构方面有许多优势，但也存在不足之处[22，48-50]：（1）因目前并没有搞清楚土壤中所有微生物的特征脂肪酸，因此，土壤中存在的某些脂肪酸无法与土壤中特定的微生物对应；（2）不同种类微生物的特征脂肪酸有可能重叠；（3）该方法很大程度上依赖特征脂肪酸来表征微生物群落结构，故标记上的变动将导致群落估算上的误差；（4）PLFA谱图分析不能从菌种和菌株的水平精确描述环境中微生物的种类；（5）土壤中难免会有植物残体存在，所以植物体内的磷脂脂肪酸可能会对土壤微生物群落的分析产生一定的干扰；（6）土样保存条件不同，得到的PLFA分析结果也不同，因而在实际研究工作中受到一定限制；（7）PLFA方法不能分析古细菌。

4 结语

PLFA方法已广泛应用于土壤微生物群落分析中，但其方法本身仍有改进之处，如分析结构特异性的PLFAs，以不断完善特定脂肪酸数据库，使PLFA方法更加精确等。随着PLFA方法的不断完善，其应用前景将会更加广阔。

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