HPLC法测定复方丹参片中丹参脂溶性成分的含量

张海江，胡静雅，袁日琴

(淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏淮安223003)

0 引言

复方丹参片由中药丹参、三七及冰片所组成，具有活血化瘀、调经止痛、安神宁心的功效，临床主要用于治疗冠心病心绞痛及急性心肌梗死。丹参脂溶性成分被认为是复方丹参片的活性成分之一，主要有隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA，并已有文献对这些成分的HPLC含量测定方法进行了研究。中国药典以丹参酮IIA作为丹参脂溶性成分的标示化合物进行复方丹参片的质控，难以准确反映复方丹参片的质量。现有的复方丹参片中丹参脂溶性成分含量测定方法的研究仅针对其中的二至三种，同时测定以上所有四种成分的分析方法尚未见文献报道。本文首先采用液质联用技术分析复方丹参片中的丹参脂溶性成分组成。在此基础上，建立了HPLC含量测定方法，同时测定隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型 HPLC仪(G1311A四元泵，G1322A脱气机，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315BDAD检测器，Chemstation色谱工作站)，Bruker Esquire Ultra 6000电喷雾－离子阱质谱仪。

1.2 试药

丹参酮I、丹参酮IIA对照品购自中国生物药品检验所，二氢丹参酮、隐丹参酮对照品购自成都康邦生物科技有限公司(HPLC方法分析，以面积归一化法计算纯度均大于98.5%)。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Merck公司)，乙酸为分析纯(江苏汉邦科技有限公司)。复方丹参片(市售:北京某厂家，批号:9122172;广州某厂家，批号:B9A023;河南某厂家，批号:20090801;辽宁某厂家，批号:090504;上海某厂家，批号:100101。)

1.3 试液制备

对照品贮备液:取对照品二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA适量，精密称定，加入甲醇制成对照品混合液，即得。

供试品溶液的制备:取复方丹参片，除去糖衣，研细，取约1 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，放入50 mL容量瓶中，超声处理15 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用尼龙膜滤过即得。

1.4 色谱/质谱分析条件

色谱柱:Venusil－XBP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm，Agela公司)带 C18 预柱(5 μm);流动相A为冰乙酸:水=0.01:100(体积比)，流动相B为冰乙酸:乙腈=0.01:100，提取方法优化的线性洗脱梯度为:0～2min时0%B(体积分数)，20 min时 15%B，35 min时 45%B，35～45 min时45%B，60 min时75%B，60 ～80 min时 75%B，90 min时90%B;含量测定的线性洗脱梯度为:0～5min时 60%B，10～25 min时 70%B，30 min时90%B，流量为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为190～400 nm，监测波长为280 nm，进样量为10 μL。

质谱分析条件:正离子检测方式。分流后进入质谱仪，流量为0.25 mL/min，干燥气体N2流量为10 L/min，干燥气温度为300℃，喷雾气体N2压力为25 psi，毛细管电压为3500 v，扫描的质荷比范围为100～1500 m/z。HPLC/MSn的扫描宽度为0.9，CID 的 Fragment ampl.为 1.5。

2 实验结果与讨论

2.1 提取方法优化

取广州厂家的复方丹参片，除去糖衣，研细，称取约1 g，放入50 ml的容量瓶中，分别以纯水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和纯甲醇为提取溶剂，参照药典方法，各加入25 ml，超声处理15 min，放冷，以提取溶剂稀释至刻度，过滤后按“1.3”项下提取方法优化色谱条件进行HPLC分析，进样量20 μL。结果见图 1。

图中保留时间在60 min之前的为丹参水溶性成分，60min之后的为丹参脂溶性成分。结果表明，随着提取溶剂中甲醇含量的增加，提取物中水溶性成分含量降低，脂溶性成分含量增大。因此，采用纯水作为丹参水溶性成分的提取溶剂，采用甲醇作为丹参脂溶性成分的提取溶剂。

通过对溶剂倍数与超声提取时间的优化，得“1.3”项下的提取条件。

图1 复方丹参片不同浓度甲醇提取液的HPLC图

2.2 丹参脂溶性成分的定性分析

取广州厂家复方丹参片，按“1.3”项方法制备供试品溶液，按“1.4”项含量测定色谱条件和质谱条件进行HPLC/MS分析，进样量为20 μL，结果见图2和表1。

通过与对照品的HPLC保留时间、UV图谱及MS数据对比，鉴定主要成分为二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA。

图2 复方丹参片中丹参脂溶性成分的HPLC图谱(a)，MS－TIC图谱(b)与标准品的HPLC图谱(c)

表1 复方丹参片中丹参脂溶性成分的HPLC/MS数据及鉴定结果

2.3 线性关系考察

逐级稀释对照品储备液1～100倍得到7个不同浓度的对照品溶液，按“1.4”项下的色谱条件进行分析，进样量为10 μL。以色谱峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度(mg·mL－1)为横坐标，绘制工作曲线，计算回归方程，见表2。

表2 各化合物的线性回归方程

2.4 精密度试验

按“1.3”项方法制备供试品溶液，按“1.4”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算精密度。二氢丹参酮 RSD 0.88%，隐丹参酮 RSD 0.42%，丹参酮I的RSD 0.26%，丹参酮IIA的RSD 0.28%。

2.5 重复性试验

按“1.3”项下方法制备同一批供试品溶液3份，进行HPLC分析(n=3)，计算每克复方丹参片中的各成分含量。二氢丹参酮含量 0.55 mg·g－1，RSD 1.86%;隐丹参酮含量 1.14 mg·g－1，RSD1.32%;丹参酮I含量2.70 mg·g－1，RSD 1.03%;丹参酮IIA含量1.86 mg·g－1，RSD 0.89%。

2.6 稳定性试验

按“1.3”项方法制备供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件连续3 d内进样测定，每天连续进样3次，测定峰面积，计算二氢丹参酮RSD 1.42%，隐丹参酮 RSD 0.95%，丹参酮 I的RSD 0.93%，丹参酮IIA的RSD 0.77%，表明样品溶液至少在48 h内稳定。

2.7 加样回收试验

配制二氢丹参酮 0.240 mg·mL－1、隐丹参酮0.448 mg·mL－1、丹参酮 I 1.080 mg·mL－1、丹参酮 IIA 0.778 mg·mL－1的对照品溶液 10 mL。分别精确量取0.8，1.0，1.2 mL 的对照品溶液各3 份于锥形瓶中，挥干，每份加入精密量取的广州厂家复方丹参片粉末约0.4 g，混合均匀，精密加入10 mL甲醇，按“1.3”项下方法制得供试品。按“1.4”项下色谱条件进行HPLC分析，每个样品进样3次，计算平均加样回收率。

2.8 样品测定结果

各厂家药片除去糖衣，研细，按“1.3”项下方法分别制备供试品溶液各3批，按“1.4”项色谱条件分析，每个样品进样3次，分别计算各厂家1 g复方丹参片中二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量(mg·g－1)，结果见表4。

表4 复方丹参片中的主要丹参脂溶性成分含量(mg·g－1)

3 结论

本研究采用液质联用技术对复方丹参片中的丹参脂溶性成分进行了鉴定，在此基础上建立了4种主要丹参酮成分的HPLC含量测定分析方法。考察结果表明，本方法准确可靠、操作简单、快速。对市场上五个厂家的复方丹参片分析结果表明，各厂家的丹参酮成分组成较为相似，主要成分均为二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA，丹参酮ⅡA含量均符合药典2005年版该品种每片含丹参酮ⅡA不得低于0.2 mg的规定。但各厂家的丹参成分含量差异较大。其中，丹参酮ⅡA的含量在1.01～1.90 mg·g－1，最大相差近一倍;丹参酮I含量最大相差4倍;二氢丹参酮和隐丹参酮含量最大相差达到10倍之多。因此，有必要提高复方丹参片的质量控制标准，使市场上复方丹参片的质量稳定性得到更加有效的保障。

［1］朱大胜，付秀娟，谭生建.HPLC法同时测定丹参酮含片中四种成分的含量［J］.中国药师，2008，11(4):301－303.

［2］谭生建，王文明，刘刚，等.HPLC法测定丹参酮滴耳液中二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量［J］.解放军药学学报，2003，19(4):269－271.

［3］郑晓珂，董三丽，冯卫生.HPLC法测定丹参中丹参素、丹参酮ⅡA、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2003，9(6):12－15.

［4］曹冬，黄喜茹，王伟，等.反相高效液相色谱法测定不同产地和种属丹参饮片中3种脂溶性成分［J］.化学试剂，2006，28(5):298 －300.

［5］黄喜茹，曹冬，詹文红.RP－HPLC法测定复方丹参片中的隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮ⅡA［J］.分析实验室，2006，25(8):116 －118.

［6］杨敏，陈昕，王秋蓉，等.复方丹参片质量评价方法研究［J］.世界科学技术:中医药现代化，2010(1):107－114.

［7］柳仁民，邓爱霞，刘道杰.RP－HPLC测定复方丹参片中丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量［J］.中成药，2005，27(3):267－269.