三种不同溶剂静电纺丝素纳米纤维的研究进展

罗 军

(广州广纺联集团有限公司，广东 广州 510655)

丝素蛋白具有良好的生物相容性、透氧性、生物可降解性，植入体内后炎症反应轻微[1]。因此，丝素蛋白被广泛应用于食品、化妆品、医药以及组织工程等多领域的研究，特别是在生物医药领域的研究成为了当今的热点。丝素蛋白的天然形态是纤维状，目前天然丝素蛋白纤维用作医用缝合线已有几十年的历史[2]，对天然丝素纤维的再生加工是拓宽其应用领域的必要前提。由于静电纺丝可以制备近似天然细胞外基质结构的微纳米纤维而成为一种热点研究技术，通过静电纺丝方法构建丝素生物医用材料成为丝素研究和静电纺丝研究的一个热点交叉而受到广泛关注。下面仅从不同纺丝溶剂的角度介绍静电纺再生丝素蛋白微纳米纤维材料及其在组织工程领域的研究进展。

1 六氟异丙醇(HFIP)作为溶剂

天然丝素蛋白由于其反平行β-折叠结构的存在导致其很难在一般溶剂中溶解。Zarkoob等[3]将家蚕丝素截成毫米级的小段放入无菌的瓶子中，采用HFIP作为溶剂在室温下溶解五个月，然后用此溶液进行静电纺丝。再生丝素膜纤维直径6.5～100 nm，经过高温氮气(150～300 ℃)处理发现纤维的结晶序列同天然纤维相似。Ohgo等[4]将家蚕再生丝素膜和脱胶蓖麻蚕丝溶解在HFA·3H2O中制成质量分数为2%～10%的静电纺丝溶液，静电纺出纤维的直径100～1 000 nm，并研究了材料的形态、结构和力学性能。Jeong等[5]将再生的丝素粉末溶解在HFIP中，制成质量浓度为7 kg/m3的溶液，然后进行静电纺丝。并研究了用水蒸气，甲醇、乙醇、丙醇蒸气诱导丝素结晶的过程。

Park等[6]将再生丝素蛋白和甲壳素按不同质量比溶解在HFIP中制成混合溶液，在相同的条件下进行静电纺丝，通过SEM观察发现随着甲壳素含量的增加，纤维的直径变细，这是由于随着混合溶液中甲壳素的增加，溶液的电导率增加。另外在甲壳素/再生丝素蛋白(Chitin/RSF)共混纳米纤维支架上培养正常人表皮角质形成细胞(NHEK)和成纤维细胞(NHEF)，结果表明：在共混纳米纤维支架中甲壳素质量分数为75%、再生丝素蛋白的质量分数为25%时，细胞在其上面增殖效果最好。Yoo等[7]进一步研究了Chitin/RSF共混纳米纤维支架材料的生物相容性，并将其与Chitin/RSF混合纳米纤维材料进行了对比，结果表明，混合纤维不如共混的好，混合纤维只有在丝素(SF)含量较高时生物相容性才好。Yeo等[8]则通过静电纺丝得到直径320～360 nm的胶原/再生丝素蛋白(Collegen/RSF)共混纤维。在其上培养人类角化细胞和成纤维细胞，并以Collegen/RSF混合纤维膜、纯胶原纤维及纯再生丝素蛋白纤维作对比。结果表明，人类成纤维细胞在共混纤维上的增殖黏附性能与在纯胶原纤维及纯再生丝素蛋白纤维上增殖黏附性能相似。人类角化细胞在共混纤维上的增殖黏附性能较在两种纯纤维材料上的增殖黏附性能有明显的下降，但在Collegen/RSF混合纤维膜上增殖黏附性能却明显好于其在共混纤维膜上的增殖与黏附。

2 甲酸作为溶剂

虽然通过HFIP可以进行SF的静电纺丝，所得材料支持细胞的黏附与生长，但存在一个重要的问题就是该溶剂十分昂贵，并不适合材料的加工使用。Kim等[9]报道了用甲酸作为再生丝素海绵膜的溶剂静电纺丝。研究了静电纺丝丝素膜的形态、空隙率和结构性质。结果表明：再生的丝素纳米纤维直径为30～120 nm，压汞法测定静电纺丝素膜空隙率为76.1%。用体积分数为50%的甲醇溶液处理后静电纺丝素膜在10 min之内就迅速产生了β-折叠结构。Sukigara等[10]用甲酸作为溶剂溶解再生的多孔海绵膜，配制了质量分数为5%～20%的溶液。他系统地研究了电场、极距、质量分数对纺丝的影响，观测了再生纤维膜的形态和纤维直径。结果表明：纺出的纤维直径在12～1 500 nm之间，溶液的质量分数是静电纺丝的最主要的影响因素，在质量分数12%～15%、场强4 kV/cm能够纺制出直径小于100 nm的纤维。Sukigara等[11]在后续的研究中用表面响应法(RSM)优化了静电纺丝的参数。从RSM模型得出：质量分数8%～10%、场强4～5 kV/cm、极距5～7 cm能得到直径小于40 nm的纤维。Ayutsede等[12]在Sukigara的基础上用FESEM观察了纤维的形态，用RS、FTIR、XRD比较了生丝、脱胶丝、静电纺丝膜的结构，同时也测试了再生纤维膜的机械性质。研究结果表明：脱胶对丝蛋白二级结构没有影响；溶解在氯化钙溶液后结晶度有所提高；透析后由于除去了钙离子结晶度降低；冷冻成干燥的海绵膜增加了分子内氢键，结晶度有稍微的提高；海绵膜溶解在甲酸中，甲酸诱导产生了β-折叠结晶。随后，Ayutsede等[13]以甲酸为溶剂，将碳纳米管分散于再生丝素蛋白甲酸溶液中，同样可以纺得形态较好的再生丝素蛋白/碳纳米管复合纳米纤维,最大断裂强力为19.1 MPa、断裂伸长5.8%。

Park 等[14]则将再生丝素蛋白和甲壳素按不同质量比溶解在甲酸中制成混合溶液，在相同的条件下进行静电纺丝，通过SEM观察发现随着甲壳素质量分数的增加，纤维的直径变细，并且在后处理时SF的结构转变也更快，但当甲壳素质量分数超过40%时容易形成珠状物。王曙东等[15]又通过静电纺丝方法构建了纤维分布较均匀、具有较高孔隙率的丝素-明胶管状支架(直径为4.5 mm)，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养实验发现：细胞可以在支架上生长、增殖。Silva 等[16]在SF甲酸溶液中加入交联剂京尼平，所纺纤维直径增大，并且由于SF纤维中含有β-折叠结构而不溶于水。Min等[17]将再生SF膜溶解在体积分数为98%的甲酸中，制成质量分数3%～15%的溶液静电纺丝得到的丝素纤维膜的纤维平均直径为80 nm。经过体积分数50%的甲醇溶液处理60 min，膜的空隙率由76.1%下降至68.1%。细胞培养结果表明，静电纺丝素膜可以促进人类角质化细胞和成纤维细胞的黏附、增殖和迁移。Alessandrino等[18]将流延法制成的再生丝素膜溶于甲酸，制得不同浓度的溶液。研究了再生家蚕丝素溶液的最佳纺丝工艺参数，再生纤维膜的细胞毒性。结果表明：在质量分数7.5%、电压24 kV、推注速度3 mL/h、极距10 cm条件下，能够制得外观光滑均匀的纤维，纤维的平均直径为(628±107)nm。SEM观测显示：L929细胞培养1天后就出现了黏附和增殖，7天后有细胞融合。Alamar blue测试表明：细胞的活性在静电纺丝素膜和组织培养对照样之间没有明显的区别。

3 水作为溶剂

虽然HFIP和甲酸都能够进行SF的静电纺丝，但是这两种溶剂均有毒，其在材料内的残余势必影响到材料在生物医药领域的应用。因此不采用有机溶剂的静电纺丝更符合生物医用材料的加工。 然而以水为溶液的静电纺丝面临以下几个问题：丝素蛋白水溶液的浓度低、黏度小、水分挥发慢等。目前国内外学者主要采用对SF水溶液进行浓缩、共混、加盐三种方法来进行SF的水溶液静电纺丝研究。Jin等[19]第一次报道了用丝素和聚氧化乙烯(PEO，分子质量900 000)混合进行静电纺丝。他将脱胶后的家蚕丝溶解在9.3 mol/L的LiBr溶液中，经过透析得到质量分数3.0%～7.2%的丝素溶液。然后将PEO按不同的比例直接加入丝素溶液中，制得质量分数4.8%～8.8%的丝素/PEO溶液。纺出的丝素纤维的直径(800±100) nm，FTIR表明静电纺丝素/PEO膜没有出现β-折叠结构，经过体积分数90%甲醇溶液处理后，由无规卷曲向β-折叠转变。PEO溶解去除后静电纺丝膜的表面变得粗糙。杭怡春等[20]将SF水溶液浓缩到质量分数20%，然后以100/0，90/10，85/15和75/25四种不同比例与30%的丝胶水溶液进行共混后纺丝，结果表明，随着溶液中丝胶质量分数的增加，体系的表观黏度增大，静电纺纤维的直径减小且直径分布变窄; 并且丝胶的存在有利于丝素蛋白从无规卷曲或α-螺旋结构向β-折叠结构转变，由此可提高静电纺纤维的力学性能。

Wang等[21]报道了直接用丝素水溶液进行静电纺丝。丝素脱胶后，用9.5 mol/L的LiBr溶解、透析、过滤，然后浓缩至质量分数17%～39%。当纺丝液的质量分数28%、电压20 kV、极距11 cm时可制得具有光滑表面的圆形再生丝，纤维的平均直径700 nm。X衍射表明静电纺再生丝素蛋白含有α-螺旋和β-折叠结构，其结构不同于无定形丝素膜，也不同于天然丝素纤维，介于两者之间。Chen等[22]也报道了用丝素水溶液进行静电纺丝，并且测定了再生丝素膜的机械性能。他将脱胶后的生丝溶解在三元溶液中，然后透析、过滤。在50～60 ℃下慢速搅拌浓缩丝素溶液至质量分数28%、30%、32%和37%进行静电纺丝。研究发现在纺丝液质量分数达到30%时溶液黏度急剧增加，当纺丝液质量分数为37%时，浓度过高致使注射器针头的溶液很快就干燥。当纺丝液质量分数达到34%、电压20 kV、距离18 cm时，静电纺丝的纤维呈条带状。FTIR、WAXD、DSC测试表明，再生的纤维构象以无规卷曲为主，经体积分数90%甲醇处理后丝素结构转向β-折叠。机械测试表明：再生静电纺丝膜的断裂强力为0.82 MPa、断裂伸长0.76%；经过甲醇处理后断裂强力为1.49 MPa、断裂伸长1.63%。Wang等[23]也采用了同轴静电纺丝制备纳米纤维的方法，用丝素作为内层溶液，PEO作为外层溶液，纺出的纤维除去PEO就得到了较细的纳米纤维。在静电纺丝过程中没有发现丝素/PEO的明显混合。通过调整毛细管内径和外径溶液的流速，可以得到一系列不同直径的纤维，除去壳结构PEO后纤维最小直径170 nm。并第一次把静电纺丝素膜置于RH 90%、25 ℃环境中诱导结构转变。放置72 h后，FTIR、XRD证实了丝素膜主要构象由无规卷曲转向β-折叠。

Zhu等[24]报道了调整再生丝素溶液pH值模拟蚕后部丝腺条件进行纺丝。把家蚕丝素脱胶，溶解在9.0 mol/L的LiBr溶液中，透析然后浓缩至质量分数20%。在溶液中以1 ∶3(v/v)加入0.1 mol/L的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液使pH值降至6.9，然后在10 ℃进一步浓缩至不同的浓度备用。用正交设计的方法研究了影响静电纺丝的参数。Cao等[25]用家蚕丝经脱胶，溶解在9.3 mol/L的LiBr溶液中，透析浓缩制得一系列浓度的再生丝素溶液。在浓缩的过程中加入LiBr或者NaCl、Na2HPO4调整纺丝溶液的导电性。研究表明：溶液质量分数、导电性和施加的电场均影响纤维的形态。质量分数从11%到17%都成功地纺出再生的丝素纳米膜。在最优的纺丝条件下(质量分数13%、流速0.2 mL/h、场强1.35 kV/cm)，纺出的纳米纤维膜经过纯乙醇处理断裂强力(11.1± 0.7)MPa，断裂伸长(10.2±1.6)%，显示了良好的机械性能。

Jin等[26]采用质量分数5.0%的PEO溶液与质量分数8%的丝素溶液以4 ∶1(wt/wt)混合制得质量分数7.5%的丝素/PEO溶液，进行静电纺丝。用体积分数90%甲醇溶液处理10 min诱导产生β-折叠结构。在37 ℃下用水冲洗48 h除去PEO，培养人的骨髓基质细胞(BMSCs)。研究结果表明：丝素/PEO纤维平均直径(700±50) nm；甲醇处理后具有良好的机械性能，断裂强力为(13.6±1.4) MPa、断裂伸长(4.0±2.0)%；SEM和MTT测试表明，在细胞培养14天后，静电纺丝膜极好的支持了BMSCs黏附、增殖。Zhang等[27]评估了静电纺丝素支架用作血管组织工程的可行性。用质量浓度7.5 kg/m3的丝素/PEO混合溶液静电纺丝，用体积分数100%的甲醇处理诱导产生β-折叠结构，放在蒸馏水中72 h去除PEO。主动脉细胞(HAECs)和冠状动脉平滑肌细胞(HCASMCs)被种植在再生的静电纺丝支架上面。结果显示：在种植HCASMCs 5天的时间内，用扫描电镜和共聚焦显微镜观测到了细胞的排列和伸长。在第4天，HAECs在丝素支架上呈索带状分布，在第7天，HAECs形成了毛细管互联的网状结构和一些可辨认的管腔。这些都表明了血管类细胞和丝素支架之间良好的相容性。Soffer等[28]在Zhang的基础上用静电纺丝的方法制作了直径为5 mm的丝素微管，用做血管移植，测试了管型材料的机械性能和生物相容性。结果显示：管型支架的破裂强力为0.108～0.010 MPa，足够承受动脉压力。断裂强力为(2.42±0.48) MPa，线性模量(2.45±0.47) MPa，机械性能与天然血管相似。支架材料很好地支持了血管内皮细胞和平滑肌细胞的生长，这些都表明了静电纺丝素支架材料在血管组织工程潜在的应用价值。Li等[29]以再生丝素蛋白水溶液静电纺得到的纳米纤维支架为材料，研究了人骨髓间质干细胞(hMSCs)体外培养骨组织的形成，并在再生丝素蛋白中加入骨形态发生蛋白2(BMP-2)和羟基磷灰石纳米颗粒(nHAP)，以考查其对骨组织形成的影响。通过将hMSCs在电纺的RSF/PEO、RSF/PEO(PEO浸出)、RSF/PEO/BMP-2、RSF/PEO/nHAP、RSF/PEO/BMP-2/nHAP五种纳米纤维支架上于成骨介质中静态培养31天后，通过SEM的观察、钙含量测定、DNA含量测定以及转录水平的表征可以看出，静电纺再生丝素蛋白基支架能促进hMSCs在其上生长和分化，其中在静电纺再生丝素蛋白支架中同时加有BMP-2和nHAP两种物质后，支架明显促进了骨组织的形成。

4 结 语

通过静电纺丝方法可以制备出性能良好的再生丝素蛋白组织工程支架，该支架材料已经显示出支持多种细胞的黏附、铺展、生长和增殖。相比于HFIP和甲酸等有毒溶剂，以水作为溶剂制备的电纺再生丝素蛋白支架会更有利于细胞在其上面生长、黏附，因为避免了有毒溶剂在支架材料中的残留。因此以水为溶剂的静电纺丝将会是SF静电纺丝研究的主要方向。

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