IGF-2和H19与肿瘤关系的研究进展

杨季红 程树杰

近年来，表观遗传学成为生物医学研究领域的热点，尤其是基因印迹在人类遗传性疾病尤其是肿瘤发生发展中的作用正引起越来越多研究者的注意［1，2］，这种表观遗传学现象正在逐渐成为国内外学者的研究重点。基因组印迹是一种导致父源性或者母源性等位基因表达的染色体修饰，由于其在新生命诞生时就已经形成，所以这种修饰很可能是一种癌前事件，尤其是胰岛素样生长因子-2(IGF-2)/H19这组印迹基因，两者的印迹缺失已经被认为是癌症发生的早期事件［3］。因此对基因印迹的研究可能为癌症的早期诊断提供一些准确的生物学指标。

1 基因印迹

基因印迹(Gene Imprinting)是近年来发现的一种不遵从孟德尔定律的、仅仅依靠单亲传递某些遗传学性状的特殊现象，也就是某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达，而其另一个等位基因不表达或者表达极弱，仿佛这些基因的不同亲本来源的一对等位基因上带有某种特殊的可供识别的印迹，故亦称作基因组印迹(Genomic Imprinting)、配子印迹(GameticImprinting)或亲源印迹(Parental Imprinting)。具有这种现象的基因称为印迹基因(Imprinted Genes)。基因印迹的产生及其控制机制是十分复杂的，目前所知仍然有限;DNA差异性甲基化、特殊的染色质结构和反义转录产物等均可能在其产生及维持过程中占有比较重要的地位，其中最具重要的是DNA差异性甲基化。基因印迹的异常可能以下述三种形式参与肿瘤的发生［2］:(1)印迹的抑癌基因的杂合性丢失(LOH)或单亲二倍体(UPD)或突变失活可能会导致某个抑癌基因的惟一有功能的拷贝的丢失或不表达;(2)印迹的癌基因的印迹丢失(LOI)或单亲二倍体(UPD)则可能导致双等位基因表达，表达量成倍增加;(3)印迹控制中心(DMR或ICR、指理论上可能会存在的某些对印迹现象有关键性影响的基因或顺式元件)的突变性失活，可能会导致某个染色体印迹区域的多个印迹的癌基因的不正常表达。目前已知的与肿瘤相关的印迹基因至少有25种之多，如IGF-2、H19、p73、NOEY2 等。

2 DNA甲基化

自从Jones等［4］在1999年研究发现包括DNA甲基化在内的共价修饰这一表观遗传学现象同样可以导致抑癌基因失活，致使癌肿发生，而且存在的范围较基因突变更为广泛以来，研究DNA甲基化与肿瘤的关系成为分子生物学领域的热点。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中，它是由DNA甲基化转移酶催化，以s-腺苷蛋氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应［5］。由于DNA局部甲基化增强在肿瘤中最为常见，与肿瘤的发生密切相关，已被认为是肿瘤抑癌基因灭活的重要原因，使其成为当前肿瘤研究的热点之一［6］。目前已报道的与肿瘤相关的甲基化基因较多，如细胞周期负调控基因RASSFIA及ppENK等、错配修复基因hMLH-1等、细胞黏附分子CD44等以及IGF2、H19、降钙素等，这些基因的甲基化异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关［7］。

3 H19基因的研究进展

H19基因属于发育印迹基因，父源印迹、母源表达。H19基因定位于小鼠7号染色体的远端、定位人染色体11p15.5，系一单拷贝基因，人类H19基因全长为3kb，共含有5个外显子及4个内含子。在第5外显子上有RsaⅠ多态性酶切位点［8］。H19 mRNA有35个小的开放阅读框(ORF)，最大的开放阅读框是ORF6，其起始于第一个外显子，终止于第二个外显子，理论上可以潜在编码一个含256个氨基酸的蛋白质分子，但是在体内以及各种细胞系中都检测不到任何与这些开放阅读框相对应的蛋白质产物，而且尚未发现H19基因与翻译系统有联系，因此大多学者认为H19基因是目前发现的惟一不表达蛋白质的印迹基因，而是在mRNA水平发挥其作用［9］，其在人和小鼠的胚胎期广泛表达，参与胚胎的正常生长、发育及小儿的行为发展。H19基因与以往发现的p53、Rb等基因一样均为抑癌基因，是一种人类发育印迹基因［10］。在许多肿瘤细胞株研究中发现，H19基因的缺失和突变率均超过了p53基因的突变率。H19基因在肿瘤的发生、发展过程中扮演着非常重要的角色，是继p53基因之后在肿瘤分子生物学上又一重大发现。国内外众多学者就其与肿瘤的关系进行了广泛而深入的研究:Ayesh等［11］发现H19mRNA能使许多基因表达上调，而这些基因与肿瘤细胞的侵袭、迁徙和血管形成有密切的关系;Ariel等［12，13］早期研究发现 H19转录产物为肿瘤胚胎 RNA，且和AFP一样可作为肝癌的标记物应用于临床;Tanos等［14］研究发现H19的过表达对食道癌及结直肠癌细胞的生长很重要;王文玲等［15］研究发现H19在宫颈癌组织中的表达阳性率明显高于宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织，并且H19的表达与肿瘤的恶性程度及术后早期复发明显相关，可作为判断宫颈癌术后早期复发的检测指标。H19的印迹异常参与了许多遗传病及肿瘤的发生，可能是一种抑制肿瘤浸润和进展的基因，有可能成为判断肿瘤浸润及进展的标志物。

3.1 与肾上腺皮质肿瘤的关系 与其他许多肿瘤相比较，肾上腺皮质肿瘤似乎减少了H19基因的表达，为了明确H19基因低表达的可能原因，高等研究了正常的肾上腺皮质、增生的肾上腺皮质、肾上腺皮质腺瘤及肾上腺皮质癌等组织H19基因的CpG岛启动子区域甲基化情况。他们发现在肾上腺皮质恶性肿瘤组织中，H19基因的CpG岛启动子区域甲基化水平较其他组织明显增加。因此，正常的H19基因的表达可以在正常及增生的肾上腺皮质组织中检测到，然而在肾上腺恶性肿瘤及腺瘤中，他们不仅惊奇地发现H19基因低表达、同时还发现IGF2基因高表达［16］。

3.2 与绒毛膜癌的关系 与肾上腺癌相比较，绒毛膜癌组织中H19基因表达上调、IGF2基因表达下调，这种改变的原因在于等位基因的充分甲基化［17］。从人类绒毛膜癌患者手术切除的标本中亦可以发现导致H19基因表达上调的大量启动子甲基化的现象。这使得研究者Arima等［17］提出，在绒毛膜癌的情况下，H19基因的启动子突变，允许它克服了启动子CpG甲基化的转录抑制，从而导致H19的表达上调。

3.3 与肝癌的关系 在肝癌组织中，H19与IGF2表达的变化通常为单等位基因表达等位基因［18］。在体外实验中，在缺氧的条件下培养的肝癌细胞株其H19基因的表达上调。

3.4 与膀胱癌的关系 膀胱黏膜是胎儿时期H19基因RNA高表达的一种组织［19］。而在膀胱癌，H19基因表达上调存在于多数阶段［20］。H19基因RNA的存在是一种膀胱癌向侵袭性癌及移行细胞癌快速发展的重要因素。在膀胱癌中，H19的印迹缺失位点已经被发现。

3.5 与乳腺癌的关系 除了青春期及孕期的乳腺组织以外，正常腺体组织是不表达H19RNA的。Adriaenssens等［21］研究发现72.5%的乳腺癌组织的H19基因显示表达增加，在这些H19表达上调的乳腺癌组织中有92.9%的基质细胞，2.9%的上皮细胞。Berteaux等［22］研究还发现乳腺癌组织中H19基因的过表达是促进细胞增殖的原因。这些组织中H19的表达与肿瘤抑制蛋白P53及细胞增殖核抗原Ki-67相关［21］。然而，肿瘤抑制蛋白Rb蛋白及转录抑制因子E2F6足以抑制H19在乳腺癌组织中的表达［22］。

4 参与的信号通路

在细胞内H19RNA的确切作用目前尚不清楚，尽管目前已经有许多已知的激活H19转录的物质及条件，并且已知H19对细胞周期活动及状态的影响，但是它是如何发挥这种作用的机制尚不明了。

4.1 上游效应-激素调节 Adriaenssens［23］在先前的研究中发现，H19的高表达与类固醇受体的存在相关。进一步的研究还发现，雌激素的主要形式17-β-雌二醇和皮质酮能够单独刺激子宫内膜细胞H19的转录，而孕激素却抑制这种效应［23］。他莫昔芬是一种雌激素受体竞争结合剂并经常用于治疗乳腺癌的化疗，17-β-雌二醇能单独刺激MCF-7细胞的H19的转录，而增加他莫昔芬后则抑制了H19的转录，这就表明在H19的转录过程中有一个假定的激素作用［23］。

4.2 下游的影响-血管生成，代谢，组织浸润和迁移 一项比较反义转染细胞和转染细胞H19的基因表达之间的差异的实验，提示以下的基因被上调:uPar，c-src激酶，酪氨酸激酶2丝裂原活化蛋白激酶，酪氨酸激酶 2，c-jun，JNK1，Janus激酶 1，TNF-a，IL6，肝素结合生长因子样生长因子，细胞间黏附分子1，NF-κB等［24］。这也表明，血管生成和FGF18可能是H19的转录RNA的潜在目标［18］。由于功能及H19基因的RNA上调途径参与的结果，目前认为H19基因的RNA在肿瘤的发生过程中起着组织浸润，转移和血管生成的关键角色［24］。

Lottin等［25］还发现，H19的表达呈正调控转录后硫氧还蛋白。至关重要的硫氧还蛋白是一种蛋白质的减少氧化代谢过程中细胞内的反应，其往往是高水平存在于过度表达H19基因的RNA的癌组织中。

5 IGF2基因

IGF2基因是第1个被证实的内源性印迹基因，Feinberg等［26］于1993年在人类中首次发现了IGF2等印迹基因，并且证实人类的IGF2基因是父系等位基因表达，母系等位基因印迹。IGF2位于人染色体11p15.5，全长8.8 kb，共有 9个外显子，8个内含子，有P1～4个启动子。IGF2基因编码的产物胰岛素样生长因子(IGF2)，是一种重要的促胚胎细胞生长因子，也是一种促有丝分裂肽，具有促进细胞有丝分裂、胚胎形成、产后生长发育等作用，生理条件下对胚胎的正常生长发育有重要作用，病理条件下能刺激肿瘤细胞的增殖。IGF2可通过自分泌或旁分泌的方式作用于细胞表面的IGF2受体。IGF2受体有Ⅰ型和Ⅱ型两种，IGF2主要通过Ⅰ型受体介导胞内信号转导而发挥作用，Ⅱ型受体介导溶酶体内吞噬溶酶体对IGF2的降解使其灭活［27］。目前IGF2被认为是多种肿瘤重要的自分泌生长因子，其过度表达已被证实具有促进细胞增殖及恶性转化的作用［28］。人类多种疾病的发生、发展与IGF2基因印迹调控异常有关。近几年来的大量研究显示，在肝癌［29］、胃癌［30］、结肠癌［31］等多种肿瘤中都发现了IGF2印迹丢失的现象，提示IGF2的印迹丢失与肿瘤的发生发展有密切相关。

6 在肿瘤治疗中的作用

在肿瘤细胞中H19RNA的功能尚不完全清楚，它在肿瘤细胞中存在多种类型表明，它可作为初步诊断，癌症复发和恶性潜在的肿瘤标志物而应用于临床［32－34］。

6.1 癌细胞中H19基因启动子的激活(以及在正常组织中的沉默)是导致基因疗法中使用H19的启动子驱动癌细胞的细胞毒性基因表达的建议。目前利用基因H19启动子驱动细胞毒性基因表达的实验正在小鼠身上开展［20］。

6.2 由H19基因与DT-A(白喉毒素)构成的DTA-H19作为膀胱癌［35］、卵巢癌［36］和胰腺癌［37］的免疫治疗方式已经进入临床实验阶段。BC-819或DTA-H19这种质粒真正体现了有针对性的治疗方法，因为所有的质粒进入分裂的细胞，但是只在肿瘤细胞中才能发现由H19转录因子存在而导致的DT-A的表达，所以它仅仅破坏肿瘤细胞而不影响正常细胞的功能。

在一项双中心、以BC-819作为表浅性膀胱癌治疗方案的Ⅰ期及Ⅱa期临床实验中［38］，有超过70%的患者未发现严重副作用及肿瘤治疗反应，其中包括仍未采取优化治疗剂量及方案的患者。

BC-819曾作为表浅性膀胱癌、卵巢癌、转移性肝癌的实验性治疗，曾有一位面临再次行膀胱全切除术的膀胱癌患者，在2004年应用该项治疗后未发现肿瘤复发，且无不良反应［38］;一位卵巢癌患者应用该项治疗后血中CA125的数值下降近50%，腹水中癌细胞亦大量减少;针对转移性肝癌患者，应用BC-819直接注射入肿瘤细胞，观察到有相当一部分肿瘤细胞坏死。

虽然在大多数癌症类型的H19的表达谱众所周知，H19RNA在影响癌细胞对药物治疗反应的作用仍是未知数。然而，最近的研究已经发现了当H19 RNA大量存在时，硫氧还蛋白和p95(NCA-90)在肿瘤细胞中表达［38，39］。这种理论可以导致更个性化的癌症治疗方案，例如，在H19过表达的肿瘤细胞中p95的表达可能表明对药物毒性有较高的耐受性，因此对于H19的过表达(和p95)的个别癌症患者，治疗可能重点为放疗或免疫治疗，从而代替化疗。

综上所述，针对恶性肿瘤组织中IGF-2及H19印迹状态及表达情况的研究，可能会对恶性肿瘤患者的早期诊断及预后提供一个新的思路。

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