王宝山 杨建旺 张继华
研究表明,在肿瘤适应低氧过程中缺氧诱导因子(HIF)起着中枢纽带作用,HIF是肿瘤适应低氧,产生一系列低氧行为的中心环节,而最近研究发现,缺氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)是介导细胞低氧反应的重要调控序列,HRE是一种缺氧敏感诱导性调控元件,在实体瘤内的活性较高[1],在肿瘤细胞生长、浸润及转移等过程中发挥着重要的作用。HIF-1α在核内作为转录因子与相关基因启动子中的乏氧反应元件相互作用,激活基因表达。据此,通过基因工程技术,在相关基因的启动子中插入HRE就能使该基因选择性地在乏氧情况下表达,构建对放、化疗敏感的真核载体转染肿瘤细胞,使乏氧肿瘤细胞在表达乏氧基因的同时表达该基因,从而形成了乏氧介导的特异性肿瘤治疗系统,提高了肿瘤的治疗效果。由于HRE及HIF-1α靶向基因治疗具有特异性强、不良反应小和疗效可靠等特点,已成为现代肿瘤治疗学新的研究重点。下面就近年来缺氧反应元件同肿瘤放化疗及基因治疗的相关研究进展作一综述。
HRE是位于低氧相关基因3’或5’端的一段DNA序列,它的核心序列可与HIF-1特异结合,受氧环境的影响,引发缺氧相关基因如血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等基因的表达[2,3]。Semenza 等[4]发现,缺氧可诱导产生一种能与促红细胞生成素(EPO)3’端增强子特异结合的DNA蛋白,当恢复为常氧环境后,此蛋白的DNA结合活性迅速丧失,该DNA结合蛋白(转录因子)称之为缺氧诱导因子(HIF-1),而EPO3’增强子第一部分DNA序列后来被定义为缺血反应元件(HRE)。HIF-1是哺乳动物体内一种重要的转录因子,由α、β两个亚基所构成,其中,H IF.1α可激活HRE。已知HRE的核心序列是(A/G)CGT(G/C)C,位于VEGF基因的5’或3’末端,在缺氧状态下,HRE与HIF-1α的结合可对病理性缺氧环境产生反应,激活VEGF基因表达的上调。另有研究表明,该调控过程的机制较为复杂,或许不同的机体细胞有着不同的信号转导通路[5,6]。
缺氧可诱导细胞内十几种基因的转录和表达发生变化,对缺氧作出应激反应。包括红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及糖酵解酶,如磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)、烯醇化酶(enolase,ENO)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDHA)等。经鉴定在侧翼区均含有缺氧反应元件(hypoxic response element,HRE),其DNA序列小于100 bp,为单拷贝或多拷贝,其核心序列为5p-TACGTGC-3p,位于mRNA起始上游的转录调控区。作为增强子,能够提供DNA结合位点,与转录因子HIF-1结合,形成转录起始复合物,启动缺氧反应基因的转录,以介导细胞对缺氧的反应[7-12]。
放射-基因治疗(radiogenetic therapy)是近年来肿瘤治疗的一种新策略[13],是将辐射敏感性调控序列与治疗基因相耦联,在肿瘤放疗时,经放射线诱导表达并将对肿瘤具有杀伤作用的基因转入肿瘤细胞,然后对肿瘤实施局部放疗,诱导基因表达。早期生长反应基因-1(early growth response gene-1,Egr-1)启动子是放射。基因治疗中较常应用的一种辐射敏感性调控序列。唐瑶云等[14]利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE-1.Egr-1调控CD/UPRT基因表达的质粒表达载体,由脂质体介导重组质粒转染喉癌Hep-2细胞,再检测CD/UPRT的表达,研究结果表明:HRE-1.Egr-1启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射干预后的Hep-2细胞CD/UPRT表达水平在缺氧下得到显著增强。钟宇等[15]利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE-1.Egr-1调控yCDg.lyTK基因表达的质粒载体;脂质体介导重组质粒转染鼻咽癌HNE-1细胞,建立稳定表达yCDglyTK基因的鼻咽癌HNE-1转染细胞;采用免疫印迹法及MTT法检测,实验结果表明,HRE-1.Egr-1嵌合启动子具有放射和乏氧诱导的双重特性,可以显著增强yCDglyTK/5-FC系统在乏氧和放射干预下对鼻咽癌HNE-1细胞的杀伤效应。杨艳明等[16]利用基因重组技术构建HRE/Egr-1双敏感启动子介导增强型绿色荧光蛋白的表达载体 pcDNA3.1.HRE/Egr-1.EGFP,质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,实验结论表明:HRE具有增强A549细胞中Egr-1启动子诱导表达的特性,对肿瘤基因.放射治疗具有参考意义。
王卫东等[17]利用基因重组构建HRE.Egr启动子及其调控的HSV.TK表达载体,经BALB/c裸鼠肺癌移植瘤模型实验发现:HRE.Egr启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射后的HSV-TK表达水平在缺氧下得到显著增强。放射联合HRE.Egr启动子可显著抑制肺癌移植瘤的生长。
目前已用于增加放射治疗效果的靶基因主要集中于VEGF、p53 、促红细胞生成素(erythro.poietin,EPO)、Survivin、sKDR以及自杀基因CD、TK等。
基因-放射治疗尽管一定程度地提升了放射杀伤肿瘤效应,但仍然距临床要求有一定距离。辐射诱导基因治疗中,虽然对个别系统的辐射激发剂量降至2 Gy,但对大多数辐射诱导启动子系统要达到显著的基因表达,一般需4~5 Gy,甚至达20~30Gy,未达到常规分次剂量2 Gy的要求,应用于临床还需要加以改进研究。
自杀基因(suicide gene),是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中,其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质,从而导致携带该基因的受体细胞被杀死,此类基因称为自杀基因。常用的自杀基因系统有tk-GCV系统、CD-5-FC系统等。
胸苷激酶基因(TK基因)是一个药敏基因(drug sensitivity gene),肿瘤细胞转导该基因后,会对本来无毒的前体药物丙氧鸟(ganciclovir,GCV)敏感,且能被其杀灭,类似于自杀,所以又称自杀基因(suicide gene)。其机制为TK酶可以将GCV或无环鸟苷(anciclovir ACV)磷酸化为一磷酸核苷,后者在细胞内二磷酸脱氧核苷激酶作用下转变为二磷酸核苷,继续磷酸化为三磷酸核苷。三磷酸核苷为细胞毒性药物,能抑制DNA聚合酶活性或作为DNA链延伸的终止子,阻止DNA合成导致细胞死亡。
王小忠等[18]采用AdEasy system构建携带受HRE调控TK基因表达的腺病毒Ad-HRE-TK,体外感染肝癌细胞系HepG2后分别在正常和低氧条件下培养。分别采用反转录.聚合酶链式扩增(RT-PCR)及蛋白质印(Western blotting)技术检测TK mRNA及蛋白表达情况,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测细胞的增殖情况。实验结论显示,低氧条件下,HRE可特异性地促进HSV-TK基因的表达,从而诱导GCV的毒性作用。
司英健等[19]将HRE调控HSV-TK和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达的真核载体pHRE.TK通过脂质体导入A549细胞,分别在乏氧(O2浓度为3%)和常氧(O2浓度为21%)环境中培养,荧光显微镜观察重组载体转染A549细胞后报告基因EGFP表达变化,并进行荧光光密度(FOD)分析;再予以GCV处理5 d后,用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果。结果表明:在乏氧的A549细胞内,HRE使报告基因EGFP表达增强;HRE能增强HSV2TK/GCV系统对乏氧环境中的A549细胞的杀伤效率。
Nitro-reductase/CB1954(NTR/CB1954)是一种较新型的自杀基因系统,通过在肿瘤细胞内表达硝基还原酶(nitro.reductase,NTR),使无毒性的前体药物CB1954转化为有毒性的4-羟胺还原产物,具有很强的肿瘤杀伤效应[20]。
王炜等[21]利用构建的由5-缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的NTR真核表达载体Pires-2EGFP-5HRE-AFPp-NTR(简称5HAN),转染人肝癌细胞株HepG2,并筛选出阳性单克隆细胞,在细胞水平上观察其对AFP阳性的肝癌细胞株的靶向性杀伤效应,实验研究显示,5HRE和AFPp双重调控的NTR/CB1954自杀基因系统在体外缺氧环境下可促进对人肝癌细胞株HepG2靶向性杀伤作用。刘军叶等[22]借助DNA重组技术构建HIF依赖性表达的重组腺病毒载体Ad-5HRE/hCMVmp-BCD。用Western blot检测细菌胞苷脱氨酶(bacterial cytosine deaminase,BCD)的表达,细胞生长抑制试验检测人肾细胞癌786.0细胞对5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)的敏感性,裸鼠移植瘤试验观察 Ad-5HRE/hCMVmp-BCD/5-FC对786.0细胞移植瘤的抑制效应。研究结果表明,HIF依赖性表达的Ad-5HRE/hCM2Vmp-BCD/5-FC自杀基因系统可显著抑制肾细胞癌生长,具有良好的临床应用前景。
从目前治疗情况看,脑胶质瘤治疗效果最好,可以使肿瘤完全消除,但停止治疗后肿瘤会复发。其它肿瘤大多只能使瘤体积缩小,而难以完全消除,归结其原因可能与基因转导效率低下,或达到瘤组织的药物浓度低等有关。
近年发现一类抗原能同时激活比一般抗原多达数千倍的T细胞,被称为“超抗原”,主要是一些细菌毒素和逆转录病毒基因产物。
中毒性休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1)是一种由金葡菌产生的超抗原,具有很强的免疫原性,只需极低的浓度即可诱发强烈的免疫反应。将超抗原和某种跨膜分子融合表达并锚定于肿瘤细胞膜,可使超抗原激发的抗肿瘤免疫应答局限于肿瘤局部,避免对表达MHC-Ⅱ类分子的正常细胞的杀伤[23]。田勇等[24]5HRE增强子联合癌胚抗原启动子(CEAp)用5HRE和CEAp构成基因表达调控元件,构建出以该元件调控跨膜型超抗原TSST-1-linker-CD80TM(TC)基因靶向表达的真核表达载体。用该载体转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LoVo及CEA阴性的人宫颈癌细胞株HeLa,利用G418筛选稳定转染的细胞。用RT-PCR检测TC融合基因的表达。分离健康人外周血淋巴细胞(PBL),用稳定转染TC的细胞裂解物进行PBL刺激实验;将PBL与稳定转染的细胞共培养。结果显示5HRE和CEAp双重调控的超抗原TSST-1在体外缺氧环境下可激活人PBL特异杀伤CEA阳性肿瘤细胞。
虽然超抗原及其相关制剂为肿瘤免疫治疗开辟了新途径,但是对人类肿瘤的治疗尚无很确定的结果,并且治疗过程中,超抗原仍呈分泌性表达,对周围正常组织可能产生不良作用,其剂量、疗程等都需要进一步摸索。这些都是超抗原基因治疗应用于临床的障碍。
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