超临界二氧化碳法制备紫杉醇脂质体

李 爽，王海君

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

笔者采用超临界二氧化碳沉析技术，将紫杉醇制备成脂质体，筛选出高包封率的紫杉醇的脂质体的最佳条件，这对紫杉醇的功效研究有着非常重要的意义。现报道如下。

1 仪器与试药

高压釜(南通市华安超临界萃取有限公司)；压力传感器(北京华美恒强科技有限公司)；柱塞计量泵(上海申贝泵业有限公司)；控温仪(余姚市工业仪表二厂)；RE－52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SK2200 HP型超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。紫杉醇原料药(江苏红豆杉药业有限公司康希分公司，含量99%以上，批号为H20067345)；紫杉醇对照品(中国药品生物制品检定所，含量99.15%，批号为1534－200202)；CO2(纯度为99.5%)；大豆卵磷脂(三泰精细化工有限责任公司)；胆固醇、无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(广州化学试剂厂，均为分析纯)；SephadexG－50葡聚糖凝胶柱(瑞典Pharmacia公司生产，上海化学试剂厂进口分装)。

2 方法与结果

2.1 脂质体制备

将大豆卵磷脂、胆固醇溶解于乙醇中，配得卵磷脂乙醇溶液，将紫杉醇原料药溶液按一定的比例溶于该卵磷脂乙醇溶液中，打开超临界二氧化碳高压釜，将混合液加入其中。密闭高压釜，经二氧化碳高压泵打入CO2，调整适宜的温度和压力，在指定的超临界温度、压强和时间下进行孵化制备脂质体，孵化结束后泄压释放CO2，旋转蒸发除去乙醇后，得到脂质体混悬液，置冰箱中4℃保存。

2.2 包封率测定

取紫杉醇脂质体1 mL，上样于SephadexG－50葡聚糖凝胶柱分离，先用30mL磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集15mL洗脱液，测定其中紫杉醇的含量，即为包封的药量。再用生理盐水10mL洗脱剩余的游离药物。另取紫杉醇脂质体1 mL，测定其中紫杉醇的含量，即为包封和未包封的药物总量。包封率按公式计算：包封率(%)=脂质体中包封的药物量/总药物量×100%。

2.3 脂质体包封率影响因素考察

2.3.1 压强

选取5个不同的压强条件，包括30，25，20，15，10MPa，分别制备脂质体，制备条件为温度45℃，时间30min，膜材配比(卵磷脂∶胆固醇)3∶1，原药与膜材的质量比1∶20，乙醇的质量分数20%。按2.2项下方法测定脂质体的包封率，结果见图1 A。可见，在较低压强下，磷脂、胆固醇在超临界CO2中的溶解度小，不易形成均一的脂质体膜，包封率很低；当压强增加到20 MPa以上时，超临界CO2对磷脂、胆固醇的溶解度显著增大，改善了胆固醇分子在磷脂上的定向排布，包埋药物的有效空间较大，紫杉醇更易以分子状态存在于载体中，使得紫杉醇脂质体的包封率、载药量均随着压强升高而增大；当压强大于20MPa后，包封率虽增加，但增加非常缓慢，且压强过大，对仪器要求也高。因此，选择压强为20MPa。

2.3.2 温度

选取9个不同的温度条件，包括20，25，30，35，40，45，50，55，60℃，分别制备脂质体，制备条件为压强20 MPa，时间30min，膜材配比(卵磷脂∶胆固醇)3∶1，原药与膜材的质量比1∶20，乙醇的质量分数20%。按2.2项下方法测定脂质体的包封率，结果见图1B。可见，温度较低时，磷脂双分子层排列紧密，紫杉醇不易包封于脂质体中，包封效果较差；当温度达到45℃时包封率最高，但随着温度继续升高，超临界CO2的密度减小，脂质膜的溶解度降低，不溶的磷脂在脂质体混悬液中析出，反而使包封率下降。因此，选择温度为45℃。

2.3.3 乙醇质量分数

选取5种不同的乙醇质量分数，包括10%，15%，20%，25%，30%，分别制备脂质体，制备条件为压强20 MPa，温度45℃，时间30min，膜材配比(卵磷脂∶胆固醇)3∶1，原药与膜材的质量比1∶20。按2.2项下方法测定脂质体的包封率，结果见图1 C。可见，在没有乙醇存在时，脂质体膜材在超临界CO2溶解度很小，形成的脂质体包封率、载药量较小；加入乙醇后，增大了磷脂与超临界CO2的分子间相互作用力，磷脂双分子层的溶解度显著增大，药物包封率随乙醇质量分数的增大而增大；但当乙醇质量分数高于20%时，过多的乙醇会破坏脂质体的稳定结构，造成脂质体膜流动性和通透性增加，使制备的脂质体包封率下降。因此，选择乙醇质量分数为20%。

2.3.4 超临界乳化处理时间

选取5个不同的乳化处理时间，分别为15，20，25，30，35min，分别制备脂质体，制备条件为压强20 MPa，温度45℃，膜材配比(卵磷脂∶胆固醇)3∶1，原药与膜材的质量比1∶20，乙醇的质量分数20%。按2.2项下方法测定脂质体的包封率，结果见图1 D。可见，超临界乳化处理时间的变化对脂质体包封率影响比较小。因此，选取30min为超临界处理时间。

2.3.5 膜材配比

选取不同的卵磷脂胆固醇比，包括1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，分别制备脂质体，制备条件为压强20MPa，温度45℃，时间30min，原药与膜材的质量比1∶20，乙醇的质量分数20%。按2.2项下方法测定脂质体的包封率，结果见图1 E。可见，随着卵磷脂的增加，脂质体的包封率呈先升高后降低的趋势，在卵磷脂∶胆固醇为3∶1时达到最高，这可能是由于原药包埋达一定比例时，胆固醇的量相对减少，包埋发生渗漏，使脂质体的稳定性减小，从而使包封率降低。因此，选择膜材配比为3∶1。

图1 脂质体包封率影响因素考察结果

2.3.6 原药与膜材的质量比

选取不同的原药与膜材比，包括1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，分别制备脂质体，制备条件为压强20MPa，温度45℃，时间30min，膜材配比(卵磷脂∶胆固醇)3∶1；乙醇的质量分数20%。按2.2项下方法测定脂质体的包封率，结果见图1 F。综合考虑，选择原药与膜材比为1∶20。

3 讨论

紫杉醇是红豆杉属植物中一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的唯一可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物[1]，主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。但因其水溶性很差，早先多以聚氧乙基代蓖麻油与无水乙醇的混合溶液作为溶剂来溶解，这样临床用药前就必须预先给予患者大剂量的地塞米松和H2受体拮抗剂，以减轻由混合溶剂引发的过敏反应和胃肠道反应，给患者带来不必要的痛苦，同时也给临床用药带来不便[2]。

脂质体通常采用的制备方法有薄膜分散法、薄膜－超声波分散法、熔融法、冻融法、注入法、逆相蒸发法、复乳法等[3]，但这些方法都必须在制备过程中使用大量对人体有害的有机溶剂。超临界CO2是一种无毒、惰性、不燃、价廉易得而又对环境友好的反应介质，且CO2能够循环使用，可减少污染、节约资源，绿色环保。目前，采用超临界CO2代替一般有机溶剂的方法在很多领域得到广泛的应用。近10年来，基于超临界流体的沉析技术已应用于微胶囊、微球等靶向药物制备领域[4－5]。借鉴微胶囊的制备方法，利用超临界CO2特殊的溶融、膨胀、沉析的性质，将紫杉醇与脂质体膜材等按一定比例混合，在一定条件下通入超临界流体，使流体渗透并溶胀磷脂双分子层，然后快速释放压力，使脂质体沉析，从而为脂质体的制备提供了一条新的途径。

笔者通过试验确定了采用超临界二氧化碳法制备紫杉醇脂质体的最佳反应条件，即超临界压强20MPa，温度45℃，时间30min，膜材配比(卵磷脂∶胆固醇)为3∶1，原药与膜材的质量比为1∶20，乙醇的质量分数为20%。在此条件下制得的脂质体的包封率为76.18%，因此该方法是一种制备脂质体的较好方法。

[1]Wani MC，Taylor HL，Wall ME，et al.Plant antitumor agents VI.The isolation and structure of taxol，a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J].J Am Chem Soc，1971，93(9)：2 325－2 327.

[2]Zhang X，Li Y，Chen X，et al.Synthesis and characterization of the paclitaxel/MPEG－PLA block copolymer conjugate[J].Biomaterials，2005，26(14)：2 121－2 128.

[3]王瑞莲，刘成梅，刘 伟.脂质体制备方法的研究进展[J].农产品加工(学刊)，2007(8)：12－14.

[4]Reverchon E，Adamia R.Nanomaterials and supercritical fluids[J].Jounrnal of Supercritical Fluids，2006，37(1)：1－22.

[5]李志义，赵顺轩，蒋静智.超临界辅助雾化法制备红霉素超细微粒[J].高校化学工程学报，2007，21(1)：43－47.