冬凌草抗菌霜剂的制备和局部抗感染实验

梁 菊，陈 姗，刘秋伟

(河南科技大学化工与制药学院，河南洛阳471003)

0 前言

冬凌草又名冰凌草，为唇形科香茶属多年生草本植物，主要分布于中国中部和南部，主产区位于河南、安徽、湖北及贵州等地。其中以河南济源产的冬凌草品相最佳［1］。传统医药学认为:冬凌草具有清热解毒、消炎止痛及健胃活血之功效。现代医学研究发现:冬凌草全草含有单萜、倍半萜和二萜等多种萜类化合物，以及黄酮类化合物、少量挥发油和生物碱。其中，二萜类化合物冬凌草甲素和冬凌草乙素被报道具有显著的抗癌活性［2］，一直是药学界的研究热点。近年来，冬凌草抗菌活性的研究也初现端倪［3］。

文献［4］报道显示，冬凌草甲素和冬凌草乙素均具有抑菌作用。冬凌草的醇提物有抗菌消炎的功效，冬凌草醇剂对金黄色葡萄球菌及甲型溶血性链球菌有明显抗菌作用，对上述细菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为1∶128及1∶256，去鞣酸不影响其抗菌作用，冬凌草煎剂亦有一定抗菌作用，但作用较弱［5］。文献［6］报道巴东冬凌草鲜叶的水提物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，对革兰氏阳性菌的抗菌活性要比对革兰氏阴性菌的高，对枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌具有杀灭作用。文献［7］称二帖类化合物冬凌草甲素和冬凌草乙素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌这3种革兰氏阳性细菌有较好的抑菌活性，其MIC值为15.63～31.25 mg/L。

到目前，冬凌草的剂型主要有片剂、滴丸、胶囊剂、注射剂和糖浆剂等［8－10］，冬凌草皮肤外用制剂的研究未见报道。本文旨在用乙醇回流提取得到冬凌草醇提物，制备冬凌草外用抗菌霜剂，通过体外抑菌实验、急性皮肤刺激性实验及局部皮肤抗感染实验，评价该霜剂的安全性和抗感染活性，为开发冬凌草皮肤外用抗菌霜剂提供实验依据。

1 实验

1.1 试剂和仪器

济源产冬凌草(购于洛阳市张仲景大药房)，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和白色念珠菌由武汉大学生命科学学院提供。其他试剂均为分析纯，购自天津化学试剂厂。

旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，生化培养箱(上海佳胜实验设备有限公司)，SW-CJ-2G型双人净化工作台(苏州净化设备有限公司)，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司)。

1.2 生药浸膏制备

称取冬凌草药材20.0 g，粉碎，加入20倍量体积分数为70%的乙醇回流提取1 h，过滤。药渣用10倍量体积分数为70%的乙醇在相同条件下再次回流提取1 h，过滤，并洗涤药渣至洗液无色。最后，将得到的洗液与滤液合并，在45℃条件下减压浓缩得浓缩液，并向其中加入质量分数为2%的活性碳，水浴回流脱色，抽滤。将所得浓缩液置于蒸发皿上，干燥箱(45℃)中干燥至恒重。

1.3 醇提物的体外抑菌实验

(1)LB固体培养基的配制:用电子天平分别称取酵母提取物2.5 g、蛋白胨5 g、氯化钠7.5 g，琼脂粉7.5 g，倾入500 mL容量瓶中，用去离子水进行定容，转入锥形瓶中，超声混合均匀，并经过121℃高温灭菌后放入超净化工作台中备用。

(2)纸片的制备:用5 mm型号的打孔器在双圈牌滤纸上打孔获得，将制好的纸片放入小烧杯中，并经121℃高温灭菌后放入超净化工作台内备用。

(3)涂布平板:分别吸取20μL细菌，滴到不同的含有LB固体培养基平板上，用涂布器将其平铺均匀。将各平板分区标记，并将纸片用镊子贴在不同的分区内。分别吸取5μL质量分数分别为0.5%、1.0%、5.0%、10%的浸膏溶液，阳性对照物(15μg/mL的氨苄西林)以及阴性对照物(甲醇∶水=3∶2)，滴于纸片的正中央。

(4)恒温培养:将做好的各个平板放入37℃生化培养箱内，恒温培养12 h后，记录抑菌圈的大小。

1.4 霜剂的制备(生药浸膏质量分数为5%)

(1)油相:1.25 g二甲硅油、1.75 g液体石蜡、2.0 g白油和1.0 g透皮促进剂。

(2)水相:0.2 g卡波姆ultra-10融入9.8 g水中，加入甘油1.0 g、PEG-400 1.0 g和1.0 g生药浸膏，最后加入1.0 g乳化剂。

(3)油相和水相分别放到60℃水浴中加热。匀浆后，将水相慢慢倒入油相中，搅拌冷却到25℃。调pH至中性。30 min后霜剂制成。

1.5 霜剂的急性皮肤刺激性实验

1.5.1 备皮

取干净白豚鼠12只，体重为(250±10)g，背部两侧剃毛，硫化钠快速脱毛，温水冲洗干净，待皮肤干燥后，涂抹甘油，保持皮肤油润光滑。将12只豚鼠随机分为两组，其中一组用小砂轮轻磨腿部两侧皮肤至破皮渗血，制造破损皮肤模型。

1.5.2 涂药

24 h后，两组同时开始给药。每天定时给药3次，每次0.2 g。每只豚鼠一侧涂抹含药霜剂，另一侧对称位置涂抹霜剂基质。给药面积20 mm×30 mm。连续给药3 d后，清洗给药处皮肤，观察皮肤情况，拍照取样。

1.6 局部皮肤抗感染实验

1.6.1 制造动物模型

18只干净白豚鼠，体重为(250±10)g，脱毛，待皮肤干燥后涂抹甘油。24 h后用注射器向豚鼠腹部两侧的皮内分别注射金黄色葡萄球菌，每侧注射点为6个(区域面积20 mm×30 mm)，使豚鼠感染金黄色葡萄球菌，如若第2天出现红肿，取其组织块进行体外微生物培养，若检测到金黄色葡萄球菌，则表示造模型成功。

1.6.2 涂药

将造模成功豚鼠随机分为两组，每组9只。其中一组为霜剂治疗组，另一组不接受任何治疗，两组均正常进食。给药组，每天定时给药3次，每次给药0.2 g(给药面积20 mm×30 mm)，连续给药1周，观察并记录结果。

2 实验结果

2.1 醇提浸膏提取率

用70%的乙醇对冬凌草进行热回流提取，经过脱色、浓缩及恒温干燥，恒重后称得生药浸膏为(1.2 ±0.1)g。所得醇提物浸膏为深绿色黏膏状物质。由生药投料20.0 g计算可知:醇提浸膏的得率为(6.0±0.5)%。

2.2 醇提物浸膏的体外抑菌活性

表1 醇提物浸膏的抑菌圈值 mm

将醇提物浸膏配制成质量分数分别为0.5%、1.0%、5.0%和10.0%的浸膏溶液进行体外抑菌实验，结果如表1所示:由表1数据可知:冬凌草的醇提浸膏溶液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和苏云金杆菌均有明显的抑制活性，并且随着浓度的增大，抑菌效果增强。而对藤黄微球菌、白色念珠菌及大肠杆菌无抑菌效果。表明该醇提取物的抑菌活性具有高选择、强效的特点。

2.3 霜剂的性能

用所得的冬凌草浸膏按照一定的配方制成霜剂，所制得的霜剂呈黄绿色稠膏状物质，而空白基质呈白色稠膏状物质。

利用干净白色豚鼠进行3 d急性皮肤刺激实验，结果显示:给药3 d后，正常皮肤未见皮肤红斑及肿胀等不良反应产生，而破损的皮肤区域也未出现红斑及肿胀等症状，并且破损皮肤已快愈合。说明该霜剂无论是对正常的皮肤还是破损的皮肤均安全无刺激。

豚鼠的皮肤炎症模型的建立表明:已感染金黄色葡萄球菌的豚鼠局部皮肤出现红肿，轻触痛叫。取红肿部位小块皮肤经体外组织培养，检测到金黄色葡萄球菌感染，表明造模成功。经1周定时定量的连续涂药后，霜剂治疗组局部皮肤红肿现象消失，且无红色斑点，注射点愈合较好。再次取小块注射点皮肤经体外微生物培养实验发现:注射部位皮肤已无细菌感染。

3 结束语

本实验将济源产的冬凌草用乙醇回流法制得冬凌草醇提浸膏，此浸膏溶液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和苏云金杆菌具有明显的抑菌效果，并且随着浓度的增大，抑菌效果增强。以此提取物制备的霜剂对金黄色葡萄球菌所致的豚鼠局部皮肤感染具有明显的治疗效果，且该霜剂无论对正常皮肤还是破损皮肤均无刺激性。

实验结果证实冬凌草醇提物具有很好的抑菌活性，结合文献［7，11］可知:冬凌草乙醇提取物的主成分为冬凌草甲素与冬凌草乙素，它们各自都具有很好的杀菌抗炎作用。所以本文所制霜剂中起抑菌作用的可能是醇提物的主成分冬凌草甲素与冬凌草乙素，但也可能是很多复杂成分的综合作用，还需要进一步的实验研究。

本文实验表明:冬凌草的醇提取霜剂具有很好的抗菌消炎功效，并且无论对正常皮肤还是破损皮肤均安全无刺激，为今后开发含冬凌草成分的外用抗菌霜剂提供了很好的实验依据。

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