2009年昆明地区流行的肠道病毒71型基因特征分析

陈俊英 潘 玥 李 华 施海晶 赵玉娇 孙强明 马绍辉

肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)属小RNA病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)，主要引起手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)、疱疹性咽峡炎、无菌性脑炎、无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹。近年来，EV71在我国广泛流行。据中国CDC报道在2008年手足口病感染者为488955例，死亡126例;2009年1155525例，死亡为353例和2010年1795336例，死亡为888例。

EV71为单股正链RNA病毒，其病毒的毒粒为二十面体立体对称，呈球形，直径约为23～33nm，核衣壳裸露，无包膜和突起。其基因组只含1个大的开放读码框架(ORF)，该ORF依次分为P1、P2和P33个区，其中P1区编码病毒的结构蛋白VP1到VP4，组成病毒衣壳，而P2和P3区编码非结构蛋白。根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异将EV71病毒分为3个基因型，即A、B、C型，B和C分别分为B1～B5和C1～C5亚型［1］。

为了解昆明地区流行的EV71基因型和流行特点，本研究对2009年昆明地区流行的EV71部分分离毒株进行全VP1(891bp)核苷酸序列扩增和测序，并与GenBank上的序列进行比对及分析，为预防和控制EV71流行提供实验依据。

材料与方法

1.材料:①细胞:VERO细胞皆由中国医学科学院医学生物学研究所免疫室保存并提供;②标本来源:34份粪便标本标本采集于疫情发生地区手足口病患者，－20℃保存;③RNA提取试剂盒:Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit.lot:KC50090501－B－G;④RT－PCR Kit:TAKARA One step RT－PCR Kit VER.2203.lot:BK1101。

2.方法:(1)病毒分离与鉴定:采用组织培养法，取粪便标本1g，加入5m l0.01M PBS(pH7.4)制成悬液，3000r/min，离心30min，用0.45μl滤器除菌过滤，接种已长成致密单层的Vero细胞，细胞培养严格按WHO分离肠道病毒规程操作，于37℃培养，培养液为含10%小牛血清的MEM。观察病毒在细胞上的细胞病变情况(CPE)，如果无CPE，盲传3代;3代后无CPE出现，判为阴性。病毒继续在Vero细胞培养增殖2代。(2)病毒的提取:按照Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒说明书操作，具体步骤为:先取样品200μl加入200μl V－L缓冲液，静置5min后加75μl V－N缓冲液混匀，12000×g离心5min;然后，取上清与300μl异丙醇(1%冰乙酸)混匀，并将混合液移入制备管中，6000×g离心1min;分别用500μlW1和800μlW2缓冲液洗涤，12000×g离心1min，最后用50μl TE洗脱，并贮存在－70℃。(3)引物设计:引物参照参考文献［2］，并根据FY23(EU812515)设计如下: EV713F:5'－TGTTYACTGGATCCTTCATGGC－3'(2070～2091);EV713R:5'－GCCAGCRTAATTTGGRTTGGCT－3' (3282～3261);EV714F:5'－TRCCATTCATGTCACCTGCGA－3'(3012～3032);EV714R:5'－TACGACACATTCCCAAACAT－3'(4320～4301)。(4)PT－PCR:采用TaKaRa公司生产的One－step RNA PCR kit(AMV)试剂盒。反应条件:50℃30 min，反转录95℃2min后94℃50s，50℃50s，72℃1.5min，循环35次，72℃延伸7min，然后转入4℃。取扩增产物5μl，用1.0%琼脂糖电泳，根据Marker位置对扩增片段进行确认。(5)序列测定和数据分析:扩增阳性的PCR产物由北京三博生物技术有限公司进行纯化和序列测定。其他有关EV71的VP1序列从NCBI的基因数据库(GenBank)上下载，通过Mega 4.1对测序结果进行处理和分析。参比序列如下:BrCr: AB204853;BrCr－TR:AB204852;J115－MAL－01: DQ341360;804－NO－03:DQ452074;1M－AUS－12－00: DQ341361;Tainan－4643－98:AF304458;Tainan－4746－98: AF304459;Tainan－5746－98:AF304457;03－KOR－00: DQ341356;06－KOR－00:DQ341355;Fuyang.Anhui.P.R.C－ 17.08－3:EU703813;F1－CHN－00:AB115490;SHZH98: AF302996;SHZH03:AY465356;1431－Yamagata－07: AB433881;1571－Yamagata－07:AB433883;AnHui－HeFei: EU697903;2007－07364:EU527983;NTU1482－TW－06: DQ846662;258－Bulgaria75:AB059814;Nagoga－Japan73: AB059813;7968－PA－87:AF009524;8102－WA－87: AF009526;NOH0037－SIN－08:FJ461788;SB11977－SAR－03:AY905549;17M－AUS－5－99:AF376094;MY1049－SAR－97:DQ341368;2120－SIN－01:AF376112;SB1647－SAR－00:AF376065。

结果

1.病毒分离及鉴定:将直接从临床样品中鉴定为EV71的34手足口病患者的粪便标本，分别接种Vero细胞后，培养分离到6个阳性分离物，收集上清，并保存在－70℃。从中分离得到的阳性毒株为6株，经微量中和试验鉴定，均确认为EV71病毒。

2.RT－PCR产物确定及测序:采用特异性引物做一步法RT－PCR，取5μl RT－PCR产物，1%琼脂糖胶电泳，大小与所设计一样。将扩增出的特异性核酸片段测序，结果与标准EV71的VP1序列同源达95%。并获得基因登陆号:HQ199874、HQ199875、JF505389、JF505390、JF505391和JF505392。

3.基因型和系统进化分析:将EV71分离株完整VP1的核苷酸与GenBank中28株的VP1经Mega4.1分析，发现此次暴发EV71与其他C基因型C1、C2、C3和C5的VP1的同源性为87.9%～89.1%，而与C4基因型的同源型为92.6%～98.5%，与SHZH98的同源性最低为92.6%，而本次6个分离株之间的同源性为95.4%～97.9%。与其他基因型的同源性为82.7%～84.6%。另外，从表1也可看出;本次分离株与C4基因型的EV71的距离较小，而与其他基因型较大。

表1 分离株与其他不同基因型分离株VP1核苷酸两两距离分析(distances＆Std.Err)

董晓楠等［3］根据分析结果并参考前人的研究，设定VP1区同源性高于85%的毒株为同一基因型，同源性高于91%的毒株为同一基因亚型;以及从基于VP1的亲缘性系统发生树(图1)，可见昆明暴发流行EV71分离株与C4基因型聚为一簇，因此，可认为该次昆明流行株EV71的基因型为C4。

图1 昆明EV71病毒分离株VP1基因进化树

4.氨基酸序列的比较:经分析发现(表2)此次昆明流行的EV71与其他C基因型C1、C2、C3和C5的VP1的氨基酸的同源性为98.3%～99.1%，而与C4基因型的同源型为97.0%～99.7%，与SHZH98的同源性最低为97.0%，而本次6个分离株之间同源性为97.3% ～99.7%。与其他基因型的同源性为96.0%～97.6%。

讨论

在本研究中，通过对昆明地区的EV71 VP1基因分析发现，昆明分离株属于C4亚型，未发现其他基因型的存在，同时也发现所有EV71各分离株序列以及与其他C4基因型之间存在差异，而且随着时间的推移，EV71发生了一定程度的变异。

表2 KM 9－09分离株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比较

接种EV71疫苗是预防和控制EV71流行的主要手段之一。目前国内已有3家开始实施临床试验，而疫苗的免疫原性好坏决定该疫苗是否成功的关键因素。Oberste等［4］研究表明，EV71的VP1与决定血清型的抗原决定因子密切相关，根据VP1区序列进行分型结果与中和试验鉴定结果一致性较好，与血清型相关性较其他结构蛋白编码区高，VP1蛋白是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。Foo等［5～7］基于EV7141株(5865/SIN/00009)的VP1合成的两个肽SP55(163～177)和SP70(208～222)能够诱导出抗EV71的中和抗体，而另一合成的SP2肽(145～159)能够诱导出良好的T细胞增殖反应和细胞因子。从EV71VP1氨基酸分析的结果来看，除SHZH98在220处由L变成F，以及258－Bulgaria75 (B1)，2120－SIN－01(B4)，7968－PA－87(B2)和17M－AUS－5－99(B3)株在氨基酸164位由D变为E外，其余各株均一致。而且C基因型氨基酸同源性为97.3% ～99.3%，与其他基因型的同源性为96.0%～97.6%。这说明C基因型在VP1氨基酸上较保守，这与以前研究结论相一致［8］。

EV71作为RNA病毒，其核苷酸的替代突变率为1.35×10－2位点/年［9］。自1969年分离到第一株EV71以来，EV71已经分为A，B，C 3个型，而且B和C两型分别又分为B1～B5和C1～C5亚型。另外，目前资料已经显示［10］，中国台湾及邻近的韩国、日本、新加坡、马来西亚均有多种基因型及亚型的流行，而且不同阶段可出现不同的EV71基因型。而中国除2008年安徽省阜阳市报道出现A基因外［11］，其余均为C4基因型。因此，对EV71监测有利于了解该病毒的变异，并对其传播途径、预防和控制具有重要的意义。

1 Tee KK，Lam TT，Chan YF，et al.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin，population dynamics，natural selection，and seasonal periodicity of the VP1 gene［J］.JVirol，2010，84(7):3339－3350

2 周世力，李琳琳，何雅青，等.我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析［J］.病毒学报，2004，20(1):1－11

3 董晓楠，应剑，陈应华.1970～2004年全球肠道病毒71型分离株的分子流行病学分析［J］.科学通报，2007，52(9):1021－1027

4 Oberste MS，Maher K，Kilpatrick，DR，et al.Molecular evolution of the human enteroviruses:correlation of serotype with VP1 sequence and application to Picornavirus classification［J］.JVirol，1999，73: 1941－1948

5 Foo DG，Alonso S，Chow VT，et al.Passive protection against lethal enterovirus71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide［J］.Microbes Infect，2007，9(11):1299－1306

6 Foo DG，Alonso S，Phoon MC，etal.dentification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides［J］.Virus Res，2007，125(1):61－68

7 Foo DG，Macary PA，Alonso S，et al.dentification of human CD4 T－cell epitopes on the VP1 capsid protein of enterovirus71［J］.Viral Immunol，2008，21(2):215－224

8 Shao MA，Jian SL，Jing JW，etal.Genetic analysis of the VP1 region of Human enterovirus 71 strains isolated in Fuyang，China，during 2008［J］.Virologica Sinica，2009，24(3):162－170

9 Bible JM，Pantelidis P，Chan PK，et al.Genetic evolution of enterovirus 71:epidemiological and pathological implications［J］.Rev Med Virol，2007，17(6):371－379

10 Solomon T，Lewthwaite P，Perera D，et al.Virology，epidemiology，pathogenesis，and control of enterovirus 71［J］.Lancet Infect Dis，2010，10(11):778－790

11 Yu H，Chen W，Chang H，etal.Genetic analysis of the VP1 region of enterovirus 71 reveals the emergence of genotype A in central China in 2008［J］.Virus Genes，2010，41(1):1－4