IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶在大肠癌中的表达研究

宋洋 徐正磊 张茹 王立生

大肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，是指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，预后不良，死亡率较高。大肠癌是大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤，是最常见的消化道恶性肿瘤之一。本研究探讨IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在大肠癌中的表达，希望能够为大肠癌基因治疗的研究发现新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为BALB/c小鼠共40只，5～6周龄，雌雄各半，由广州动物实验中心提供。40只小鼠随机分为正常组和大肠癌组。细胞免疫荧光标记的二抗购自Dako公司，大肠癌细胞株由本实验室传代培养，羊抗人PI3K多克隆抗体工作液购自Santa cruz 公司，流式细胞仪购自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大肠癌动物模型 在小鼠腹背侧部皮下注射0.2ml含5×106个人大肠癌细胞株的悬液, 成瘤后用组织块套管针法皮下移植为实体瘤。其中结肠癌12只，直肠癌8只。

1.2.2 制备单细胞悬液 取正常组和大肠癌组小鼠的组织，乙醇固定，分别放在不锈钢网上（120目），下置一平皿。将组织剪碎，用生理盐水冲洗组织同时用镊子轻轻揉搓。用300目的铜网过滤平皿中的悬液，去除细胞团块，收集细胞悬液。以600r/min离心2min，然后收集细胞沉淀。

1.2.3 免疫荧光标记 取单细胞悬液1×106/ml个细胞，加入0.1 ml羊抗人PI3K多克隆抗体工作液，室温孵育30min，加入10 ml PBS清洗，离心后弃上清。为除去未结合的荧光二抗加入100μl羊抗鼠二抗工作液，室温孵育30min（避光），加入10 ml PBS清洗后同上离心，弃上清。经500目铜网过滤，加入0.1ml PBS悬浮细胞后上机检测。设代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的阳性对照，对蛋白免疫荧光标记物进行测定。

1.3 蛋白表达分析 以荧光指数（FI）表示, FI=(样品蛋白表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常对照样品平均荧光强度，FI≤1.0为阴性表达，FI＞1.0为阳性表达。

1.4 数据分析 采用统计软件SPSS12.0对数据进行处理，两组计量资料比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

正常组20例正常大肠组织中有5例FI＜1.0，阳性表达率为75.0%；大肠癌组20例均FI＞1.0，阳性表达率为100.0%，且FI均比正常组高。两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组平均FI=（1.1±0.3），大肠癌组平均FI=（1.4±0.2），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，由于人们膳食结构的改变，大肠癌发病率有上升趋势。大肠癌恶性度较高，包括结肠癌和直肠癌。传统的观点认为，肿瘤的发生是抑癌基因失活、癌基因激活所致。近年来的研究在早期诊断、治疗方法等方面有了较大进展，但大肠癌的五年生存率仍然较低[1]。新的观点认为细胞癌变是由于信号转导途径的活性异常，刺激细胞异常增殖所致。近年来的研究发现，细胞生长、增殖、分化等信号转导途径的组成成员包括许多癌基因和抑癌基因的相关产物，PI3K是一种与细胞内信号传导有关的脂类第二信使[2]。磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸、磷脂酰肌醇-3,-4,-5-三磷酸(ptdins3,4,5ps,PIP3)作为第二信使发挥作用，这些脂类主要由磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(ptdins4,5p2.PIP2)和磷酸化磷脂酰肌醇-4-磷酸(ptdins4,PI4P)生成。

增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节均有PI3K信号参与，IA PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生、发展过程中的作用主要表现在促进细胞转化表型的改变。各种癌基因酪氨酸激酶受体均能活化PI3K[3]。Akt可通过以下途径影响大肠癌的生长：①活化NF-KB，增加抑凋亡基因bcl-2的表达；②参与调节pRB的磷酸化过程，调控p27KIPl、cyclinD的表达和活性；③对凋亡级联反应的调节蛋白BAD和蛋白水解酶Caspase-g直接磷酸化，从而阻止凋亡，促进细胞的生存。有研究认为在人类肿瘤中，PI3K/Akt通路关键分子的编码基因在DNA水平上存在结构的变化，能引起PI3K的组成性活化和细胞转化，大肠癌中p85α基因在iSH2区域的缺失和突变能导致PI3K的激活[4-5]。而抑制PI3K活性后细胞的增殖明显被抑制，表现为细胞周期阻滞、G1期相关蛋白CyclinDl和CDK4表达量减少以及Rb的磷酸化等，这种细胞周期的阻滞能因细胞中活性Akt及其下游分子p70S6K的表达而恢复，揭示PI3K至少在这些肿瘤中是原癌基因[6]。

本研究发现PI3K蛋白在大肠癌癌变过程中阳性表达率逐渐升高，提示PI3K蛋白在大肠癌癌变过程中表达异常。

[1]孙嫣，田华，肖法 ，等.PI3K p85α在大肠癌癌变过程中的表达及意义[J].南方医科大学学报,2009,29(3)：416-418.

[2]王舟,王学春,赵瑞花,等.FAK PI3K在胃癌中的表达及相关性研究[J].济宁医学院学报，2006，29（4）：3-6.

[3]Dong Z, Huang C, Ma WY. PI-3 kinase in signal transduction,cell transformation, and as a target for chemoprevention of cancer[J].Anticancer Res, 2001,19(5A)：3743-3747.

[4]马豫茜,关婧,倪丽，等.PI3K p110在大肠癌癌变过程中的表达及意义[J].胃肠病学和肝病学杂志,2010,19(12)：1078-1080.

[5]郭运生.大肠癌组织中PI3K、Akt和HGF的表达变化及意义[J].山东医药,2010,50(46)：77-78.

[6]黄晓丽,郑玉霞,廖再波,等.磷脂酰肌醇3 激酶信号传导通路在溃疡性结肠炎发病中的作用[J].四川大学学报(医学版)，2008，39(3)：364-367.