中性粒细胞和心肌缺血再灌注损伤

陈莉

急性心肌梗死（Acute Myocardial infartion, AMI）是冠状动脉急性闭塞导致部分心肌缺血性坏死的过程，是严重危害人类的常见病和多发病。心肌缺血最根本的治疗措施是恢复血供，但重建血供本身将在一定程度上引起组织的进一步损伤。在心肌缺血的基础上继以再灌注而出现的心肌损伤，称为心肌缺血再灌注损伤（Myocaedial Ischemia Reperfusion Injury, MIRI）。中性粒细胞（Polymorphnuclear neutrophil, PMN）是参与心肌缺血再灌注损伤重要细胞成份之一，它在缺血心肌的浸润可引起并加剧心肌细胞的再灌注损伤。

1 PMN在缺血再灌住心肌中的浸润

心肌再灌注最早的结局之一就是无复流现象。Kaminski KA与合作者[1]证实PMN聚集于微血管是无复流现象的主要原因。缺血后心肌释放多种趋化性物质，吸引PMN在再灌注心肌中聚集。

1.1 补体

心肌缺血引起补体活化级联反应，可产生过敏毒素C3a、C4a、C5a及补体膜攻击复合体（Membrane Attack Complex,MAC），这种微分子复合物MAC在插入膜脂物质双层时行成微孔，导致细胞溶解。C5a和其它过敏毒素还可以增加血管通透性，介导平滑肌细胞收缩，加剧缺血组织损伤。C5a是潜在的PMN趋化因子，导致PMN局部浸润。C5a的受体拮抗剂可减少缺血再灌注后心肌梗死范围[2]。

在实验性冠状动脉闭塞的动物模型中注射眼镜蛇毒液因子，来清除补体，可减少心肌坏死[3]。可溶性补体受体-1（souble Complement Receptor, sCR1）可通过结合C3、C5转化酶阻止补体活化，水解未活化的C3a、C4a，sCR1的保护作用也可减少PMN聚集，在大鼠MIRI模型中显著减少心肌梗死面积。

1.2 趋化因子

趋化因子可迅速介导PMN改变形态，使之变得不易移动，局限于微血管，阻止缺血后微血管的再灌注[4]。四个趋化因子超家族(CXC、CC、C和CX3C)是根据它们的保守氨基酸残基序列的分布来分类的。IL-8是一种重要的CXC趋化因子(这一趋化因子亚家族所有成员的多肽链中有4个保守的丝氨酸残基，其中近N端的2个丝氨酸残基之间被任意一个氨基酸残基分隔，故称为CXC)，其主要生物活性是趋化并激活PMN。

IL-8的产生在不同阶段主要来源不同：急性缺血期主要由缺血区血管内皮细胞产生并发生一定的PMN趋化作用，但此时产生量少；在缺血后期及再灌注期，由于补体激活，补体的中间产物C5a及终末产物MAC，内皮源性IL-8等发挥PMN 趋化作用，引起炎症部位PMN浸润、脱颗粒，进而产生释放大量IL-8。

1.3 花生四烯酸代谢产物和血小板活化因子

脂源性介质也是调节缺血再灌注后心肌中PMN积聚的重要因子。活化的PMN产生白三烯（LTB4），主要由5-脂加氧酶氧化花生四烯酸而产生。LTB4是潜在的PMN趋化因子。

血小板活化因子（Platelet Activating Factor，PAF）是由内皮细胞产生的磷脂介质，作为潜在趋化因子，它能促进PMN粘附内皮细胞[5]。最近的研究显示血小板活化因子-醋酸水解酶（PAF-AH）可抑制PAF，在兔试验性心肌梗死模型中能显著减少PMN浸润，提高心脏收缩功能[6]。PAF也可刺激血小板与PMN协同，扩大损伤。

2 PMN在缺血再灌注心肌中的迁移

由P M N介导的心肌损伤涉及P M N与血管内皮细胞（Endothelium Cell,EC）的粘附，跨血管内皮迁移及其与心肌细胞的粘附等一系列过程。而急性心肌缺血后PMN、内皮细胞、心肌细胞表面的粘附分子(Adhesion Molecule,AM)的改变是造成心肌损伤的起始关键所在。正常情况下，PMN很少与血管壁作用。在缺血后的炎症刺激下，PMN在毛细血管静脉移动的速度明显比血流速度慢，滚动的PMN停留在内皮细胞上，在趋化因子刺激下几分钟内改变形状，外渗进入血管外组织。这些步骤中的每一步都需要AM的上调或活化[7]。已证实参与PMN与血管内皮细胞的相互作用的有3个AM家族：选择素(selectins)，整合素(integrins)，免疫球蛋白(immunoglobulins)。

2.1 选择素

选择素与早期再灌注中PMN与血管内皮细胞相对较弱的相互作用有关，介导PMN在内皮细胞的滚动。选择素家族包括3个紧密联系的细胞表面糖蛋白分子：L-选择素(CD62L)，E-选择素(CD62E)，P-选择素(CD62P，GMP-140)。选择素家族的每一个成员都以前缀来命名。前缀是通过分子首先表达的细胞类型来选择的。L-选择素由白细胞在一些分化阶段表达，循环中的PMN、单核细胞、嗜酸性细胞、T细胞、B细胞表达L-选择素，这些细胞活化后L-选择素从细胞表面脱落[8]。E-选择素主要由内皮细胞表达，但仅在细胞因子（如TNF-α、IL-1）或细菌内毒素刺激内皮细胞后4～6h表达。P-选择素主要存在于内皮细胞Weibel-Palade小体和血小板颗粒中。在前炎症介质活化后的几分钟内，P-选择素不需要合成新的蛋白质就可以移动到细胞表面，活化内皮细胞。

不像大多数细胞粘附分子在蛋白质-蛋白质相互作用的基础上结合配体，选择素的配体是蛋白质支架或载脂分子组成，并由一定的碳水化合物修饰[9]。选择素的配体有多种结构，包括乙二脂，sialyl Lewisx。已证实L-选择素的作用之一是将sialyl Lewisx作为配体传递给E-选择素、P-选择素。P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）是人PMN上P-选择素的主要配体，可溶性PSGL-1的重组体可在猫的冠脉闭塞再灌注模型中，显著减少心肌坏死[10]。

2.2 β2 整合素(CD11/CD18)

尽管滚动对于PMN最终在血流条件下牢固粘附于血管内皮是首要的，但是选择素依赖的PMN粘附并不会导致牢固的粘附和跨内皮细胞的迁移，除非有整合素和其它的细胞粘附分子[11]。

整合素是异二聚体的跨膜糖蛋白，由α、β两个单位非共价结合。目前研究比较清楚的是β2整合素，主要表达于PMN表面。由3种不同的亚单位（CD11a、CD11b、CD11c）和β亚单位（CD18）结合，形成3种类型。淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1,LFA-1）即CD11a/CD18，巨噬细胞分化抗原-1(macrophage differentiation antigen-1,MAC-1)即CD11b/CD18，P150/95即CD11c/CD18。

必须强调，再灌注损伤也并不是完全依赖PMN介导的作用，缺血后用缓冲液再灌注的心肌，也没有任何血细胞存在，也产生严重的心肌损伤：心肌迟钝，梗死。近来报道ICAM-1和P-选择素基因同时敲除的小鼠在缺血再灌注中有较少PMN积聚，但与野生型小鼠比较，没有心肌梗死范围的不同[12]。

与整合素有关的策略被很多研究者用来干预炎症进程。抑制LAF-1作用的抗体可有效地阻断PMN迁移。LAF-1缺乏的小鼠炎症部位的PMN渗出显著减少。相比之下，MAC-1缺乏的小鼠并不显示PMN迁移的缺陷,这些发现证实是LAF-1和 MAC-1对于炎症部位PMN渗出的影响[13]。

2.3 免疫球蛋白超家族

细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1），血管细胞粘附分子-1（vascular adhesion molecule-1，VCAM-1），血小板-内皮细胞粘附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)是免疫球蛋白超家族成员。整合素的对应结构是免疫球蛋白超家族成员。LAF-1识别ICAM-1及ICAM-2，MAC-1也与ICAM-1相结合。CD11c/CD18的对应结构尚未鉴定出来。

PECAM-1主要在血小板、PMN、内皮细胞表面表达，与PMN跨内皮细胞迁移有关。ICAM-1主要在血管内皮细胞表达。LFA-1与ICAM-1的结合使PMN与内皮细胞紧密粘附，接着PMN迁移进入心肌。有报道研究PMN粘附犬离体心肌的机制，发现在细胞因子IL-1、TNF-α、IL-6的刺激下心肌细胞也可以表达ICAM-1，PMN的活化可由酵母多糖活化的血浆（C5的来源），PAF和IL-8来引起。MAC-1与ICAM-1的相互作用对于PMN与心肌细胞的粘附是特异性的。这种相互作用可完全被ICAM-1、CD11b和CD18的抗体所阻断，不受CD11a抗体的影响。CD11a抗体可阻断PMN与内皮细胞的粘附。粘附的PMN有强烈的细胞毒性，在PMN粘附后的心肌可观察到持久收缩。而且在PMN与内皮细胞粘附的过程中，显示LFA-1/ICAM-1活性，细胞外基质中没有超氧化物产生。而PMN与心肌细胞粘附，显示MAC-1/ICAM-1活性，产生PMN呼吸爆炸，造成心肌氧化损伤。

因为在缺血后心肌淋巴液中的IL-6可以刺激心肌表达ICAM-1，所以研究者开始关注IL-6 mRNA在缺血再灌注心肌中的表达，他们在实验中发现在IL-6迅速表达的同一缺血区域ICAM-1 mRNA的表达也达峰值，心肌梗死边缘区单核细胞、心肌细胞在再灌注后1h内产生再灌注依赖性的ICAM-1 mRNA表达[14]。用TNF-α的中和抗体又可部分阻止IL-6的上调，显示TNF-α作为上游细胞因子激活炎症级联反应的重要作用。

3 PMN介导的组织损伤的机制

PMN除了可以介导微血管阻塞之外，还可以通过释放毒性物质直接损伤实质细胞，粘附的PMN可以分泌蛋白水解酶，氧自由基等损伤周围组织细胞。

3.1 氧自由基（oxygen free-radical，OFR）

在再灌注后，由于可溶性的前炎症因子、C5a、PAF的刺激，PMN在高代谢和高氧耗的情况下，产生呼吸爆炸。PMN膜上的NADPH氧化酶产生超氧化阴离子、过氧化氢、OH自由基。同时缺血再灌注后抗氧化性降低，打破了氧自由基生成与清除之间的平衡。氧自由基损伤的敏感目标是血管内皮细胞。氧自由基可以促进内皮细胞源性的前炎症介质的释放，引起内皮细胞上的粘附分子表达[15-16]。由氧自由基介导的内皮细胞损伤还可以增加内皮通透性，引起更多PMN粘附，并减少内皮细胞源性的抗PMN物质，如NO(nitric oxide)、腺嘌呤核苷。NO作为一个潜在的抗炎因子，可抑制粘附分子表达，且对缺血后心肌有正性肌力作用。此外，氧自由基可以氧化低密度脂蛋白（low desity lipopretein，LDL）产生导致动脉粥样硬化形成的产物，在PMN氧自由基产生和心脏病之间产生联系。PMN颗粒中还有髓过氧化物（myeloperoxidase，MPO），与过氧化氢结合形成酶底物复合物，氧化卤化物，特别是Cl，产生重要的PMN源性细胞毒性分子：次氯酸。由于它强大的氧化性引起细胞毒性作用。除了直接损伤组织，氧自由基的潜在作用可产生PMN趋化信号，包括刺激补体产生，介导内皮细胞上P-选择素、PAF的表达[17]，上调趋化因子。

脂质过氧化反应也是氧自由基介导损伤的主要机制。Altavilla[18]等观察到LRFI042，一种新的VitE类似物，以剂量依赖的方式，在再灌注后5min给予可显著减少心梗面积。应用SOD和过氧化氢酶可以减少缺血再灌注中的凋亡，提示在此阶段的凋亡是依赖氧化应激的[19]。

3.2 蛋白酶

PMN降解可释放蛋白水解酶、弹性酶、胶原酶、磷脂酶、髓过氧化物酶，可以水解细胞外基质成分：弹性蛋白、纤维结合素、Ⅱ型胶原。

4 小结

心肌缺血后的再灌注在停止缺血进程的同时，也迅速引发了与炎症反应相似的一系列级联反应，大部分由PMN介导针对宿主组织，如内皮细胞、心肌细胞。PMN由缺血时产生的趋化因子、前炎症介质吸引到再灌注心肌，通过选择素介导的滚动与内皮细胞相互作用，开始松弛的粘附，后来由CD11/CD18复合体与ICAM-1介导了内皮细胞与PMN牢固的粘附，接着PMN跨内皮细胞迁移，进入心肌。活化的PMN可释放氧自由基、蛋白水解酶、趋化因子及花生四烯酸产物等细胞毒物质。这一系列事件产生再灌注损伤：内皮细胞功能失调，微血管塌陷，血流异常，心肌梗死，凋亡。药物治疗就可针对这一系列事件的各种成分，包括清除PMN，抑制PMN，内皮细胞上的粘附分子。而且PMN不是仅仅只与急性心肌损伤有关，还与长期的组织损伤和/或组织功能的调节有关。Kyne[20]等报告，检测急性心肌梗死病人入院时的外周血中PMN比例，可预测近期发生充血性心力衰竭的风险。Kyne等的工作延伸了PMN介导损伤的时间框架，也提供了一个潜在的治疗目标来延缓心脏失代偿的进程。对PMN介导的心肌缺血再灌注损伤的越来越多的基础研究的认识，将有利于发展新的策略和治疗目标缓解冠状动脉疾病，血管成形术，心脏外科手术的后果。

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