牛结节性皮肤病及其病原检测方法研究进展＊

周雪梅，李应国，聂 奎，聂福平＊，王 昱，肖进文

（1.西南大学动物科技学院，重庆 400715；2.重庆出入境检验检疫局，重庆 400020；3.重庆进出口食品安全工程中心，重庆 400020）

牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD）又称牛疙瘩皮肤病或牛结节疹，是由牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）引起的一种牛的急性、亚急性传染病［1］。被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病。该病的感染率为5%～85%，病死率为10%；其主要临床特征为病牛皮肤表面出现大量疙瘩样结节，体温升高至40℃以上，消瘦，产奶量骤减约50%。同时，还可致原发性和继发性肺炎；感染的患畜四肢因患滑膜炎和腱鞘炎而引起跛行；患病母畜流产，流产胎儿被结节性小瘤包裹，并发子宫内膜炎；公牛暂时或永久不育［2］；皮张鞣制后具有凹陷或孔洞而造成巨大的经济损失，对养牛业危害较大。

1 病原学

牛结节性皮肤病病毒（LSD）与山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox virus，SPV）同属于痘病毒科（Poxviridae）、羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV）。电镜观察，病毒粒子呈砖块状或短管状，由1个核、2个侧体和2层脂质外膜组成，大小约为290nm×270nm，属于较小的痘病毒病毒粒子，是惟一在细胞浆内复制的有囊膜的双股DNA病毒［3］。迄今为止，该病毒只有1个血清型，代表株为Neethling株。而Le Goff根据不同地区分离毒株的GPCR基因的同源性差异，将其分为两类，即同源性高的南非Neethling vaccine株，Neethling vaccine株以及肯尼亚绵羊痘和山羊痘病毒（KSGPV），同源性较低的 NI－2490株以及新近NCBI收录的毒株。

LSDV广泛存在于皮肤、真皮损伤部位、结痂、唾液、鼻汁、牛乳、精液、肌肉、脾脏、淋巴结等处。病毒粒子可于pH6.6～8.6环境中长期存活。在4℃甘油盐水和组织培养液内存活4月～6月。干燥病变中的病毒存活1个月以上，在干燥圈舍内可存活几个月。病毒耐冻融，置－20℃以下保存，可保持活力达几年之久；在－80℃可保存10年。对热敏感，55℃2h或65℃30min可灭活。对直射阳光、酸、碱和大多数常用消毒药（酒精、升汞、碘酒、来苏尔、福尔马林、石炭酸等）均较敏感，对氯仿和乙醚也敏感［4］。

经BLAST比对，LSDV与SPV、GPV的基因组同源性高［3］。Stram Y 等［5］研究证明，LSDV 与SPV的关系更为密切。Tulmane R等用限制性内切酶的方法分析3种病毒，有相似的电泳图谱，认为这是病毒在不同地区适应不同宿主的结果。殷震等［6］认为LSDV的形成与羊痘病毒属的特性“属内各成员发生遗传性重组，各属内或各属间的成员则可发生非遗传性复活”有关。在自然感染状态下，羊痘病毒属的病毒具有明显的宿主倾向性，对同源宿主的致病力要强于异源动物，LSDV一般不感染山羊和绵羊。GPV、SPV和LSDV还存在着共同的抗原和广泛的交叉中和反应性抗原，用异源动物体分离的病毒制备的疫苗对同源动物具有免疫保护力。

2 流行病学

2.1 流行情况

本病以前仅局限于非洲地区，在非洲中南部流行比较严重，后传到非洲北部地区。该病于1929年在赞比亚首次发生，1943年传到波扎那，后传入南非，引起800万牛只发病，造成了重大的经济损失。1957年在肯尼亚发生，1977年毛利塔尼亚、加纳、利比里亚均有该病的报道。1981年－1986年，坦桑尼亚、肯尼亚、津巴布韦、索马里、喀麦隆均发生该病，死亡率在20%左右。1989年在以色列单独暴发流行，同年以色列建立了除非洲外第一个LSD实验室。近5年来，LSD流行速度加快，并有复发的情形出现。2006年4月19日，埃及农业部宣布埃及暴发LSD，从2006年1月7日到4月9日294 576头牛感染该病，其中死亡771头。2006年9月4日，以色列农业部首席兽医官宣布以色列发生LSD疫情，6月20日～9月3日4 000头牛发病。2007年12月17日，以色列农业部再次向OIE报告发生LSD疫情，2007年6月7日～2007年12月17日4 337头牛发病。2009年3月3日，毛里求斯农业部向OIE报告暴发2起LSD疫情，74头牛发病，死亡2头，于2008年5月12日疫情得到控制。2009年10月12日，马里农业部向OIE报告发生9起LSD疫情，2008年8月10日～2009年10月12日，8 722头发病，死亡12头，宰杀10头。2009年10月10日宣布疫情得到有效的控制。2010年2月2日，莫桑比克农业部向OIE报告莫桑比克发生4起LSD疫情，并呈地方流行，从2007年1月6日至报告日期，共有3 092头牛发病，死亡5头。2010年，该病在贝宁、波扎那、布基纳法索、马达加斯加、纳米比亚、尼日尼亚、阿曼、苏丹、斯威士兰、多哥、赞比亚、津巴布韦等地区和国家均有发生［7］。在我国，1978年谢家麒等在河南扶沟、通许首次发现LSD［8］，2002年黑龙江省海伦市发生2起LSD疫情，引起5头牛发病，死亡2头［9］。但该病并未在我国引起流行，也有学者认为我国尚无LSD［10］。但从目前该病的流行趋势看，已有向非洲以外的世界各地蔓延的可能性，加强对该病的监测已非常必要。

2.2 传染源和易感动物

牛是该病病原的自然宿主，无性别、品种差异。通常情况下普通牛比较易感，亚洲水牛、奶牛也易感。该病感染率在5%～85%，病死率为10%。绵羊、山羊及一些野生动物，如长角羚羊、长颈鹿、黑斑羚可被人工感染［11］，但仅有45%～50%的感染动物表现出临床症状。同一条件下的牛群，隐性感染与急性死亡的临床表现差异较大，可能与传播媒介的状况有关。

2.3 传播途径

LSDV主要通过节肢动物传播，库蚊属、伊蚊属和厩螫蝇在传播过程中起着非常重要的作用，有观点认为病毒通过牛－昆虫－牛循环链不断增殖而引起暴发。同时，直接接触、实验接种都可能感染该病毒。目前，在没有传播媒介的作用下，怀疑可经过唾液传播［12］。

3 病原检测方法

牛结节性皮肤病患牛的急性病变根据临床症状可初步诊断，但亚急性和非典型病例以及一些与LSD的临床症状相似的疾病，如牛疱疹性乳头炎、嗜皮菌病、癣、昆虫或蜱的叮咬、贝诺虫病、金钱癣、牛皮蝇叮咬、过敏、牛丘疹性口炎、荨麻疹和皮肤结核等，因此很难进行鉴别诊断。而只能用实验室诊断方法进行确诊。

3.1 病原分离鉴定

病料采集自病畜活体或死后的皮肤结节、肺脏、淋巴结等，用于病毒分离、培养和检测常用牛、山羊及绵羊的原代及传代细胞培养LSDV，并认为从绵羊体内分离得到的病原在羔羊睾丸的原代及继代细胞培养最为敏感。用透射电子显微镜检查是初步检查LSDV最直接快速的方法。将病料研磨制成悬浊液，滴1滴悬浊液在腊板上，1min后，加1滴pH 7.8的Tris／EDTA buffer 20s，然后滴加pH 7.2的10g／L的磷钨酸10s。用滤纸吸干或自然干燥后镜检。该病毒粒子呈砖块状或短管状，大小约为290 nm×270nm。

3.2 血清学检测

LSDV无血凝素，不能凝集红细胞，因此，不能应用直接血凝试验［6］。由于LSDV抗体与其他痘病毒引起的牛丘疹性口炎、伪LSD等的抗原之间存在交叉反应，琼脂凝胶免疫扩散试验和免疫荧光抗体试验特异性较低。世界动物卫生组织（OIE）推荐的血清学诊断方法包括间接荧光抗体试验（IFAT）、病毒中和试验（VNT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白印迹（Western blot）［13］。LSDV 的p32抗原具有很好的敏感性和特异性，但由于蛋白印迹耗费较大和操作困难使其在应用上有一定的局限性。病毒中和试验常用且特异性最高，但由于LSDV感染主要引起细胞免疫，产生中和抗体水平低，其检测灵敏度也较低，对于再次感染或中和抗体水平低的动物，该方法较难确诊［14］。Gari G等［15］应用间接荧光抗体技术检测埃色俄比亚南部地区（263例）和北部地区的（200例）病料，其灵敏度和特异性与病毒中和试验的灵敏度和特异性相符合。该方法可用于流行病学调查的初步筛选。

以上方法仅适用于该病流行地区的检测，但没有流行的地区由于没有接种LSDV活毒苗的，上述检测方法难以进行。Carn V M等［16］构建了绵羊痘KS－1株P32重组抗原，并与LSDV抗体反应进行间接ELISA检测，建立了用于检测从山羊、绵羊、牛的活组织样品中分离的羊痘病毒的抗原捕捉ELISA方法，该法适合检测组织培养物中的病毒。Heine H G等［17］应用痘苗病毒H3L基因的同源基因p32，构建LSDV Neethling株的原核表达载体，并以该重组蛋白作为抗原建立了具有较高特异性的间接ELISA方法。全长P32表达量较低，截短的P32表达量有所提高，但对抗原性有影响。国内外不少研究人员正研究CaPV其他特异性强，表达量高的功能基因。

3.3 分子生物学检测

GPV、SPV和LSDV之间存在共同的抗原和广泛的交叉中和反应性抗原，因此，血清学检验方法不能鉴别GPV、SPV和LSDV。核酸诊断技术相对于血清学诊断特异性较高。通过限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）可以鉴别 SPV、GPV 和 LSDV。Ireland D等［18］根据吸附蛋白和融合蛋白等山羊痘病毒属的特异性蛋白基因，建立了用于活体或组织培养的山羊痘病毒属病毒的PCR检测方法，利用限制性内切酶EcoRⅠ和DraⅠ的识别位点来证实PCR产物的特异性。Heine D N等［19］基于痘苗病毒H3L基因的同源基因P32，建立了区分正痘病毒和副痘病毒的PCR方法。利用限制性内切酶EcoⅤ对LSDV与SPV的特性，从而鉴别LSDV与SPV。Stram Y等［20］比较了LSDV与绵羊痘病毒和山羊痘病毒的全长基因组，根据其末端不同源区，设计引物，建立了鉴别LSDV、SPV和GPV的PCRRFLP方法。同时，将其与GenBank中收录的SPV、GPV及LSDV其他毒株的末端序列（774位～1237位）进行系统进化树分析，可区分山羊痘病毒、绵羊痘病毒和LSDV，但不能区分不同地区的毒株。Le Goff C［21］又根据G蛋白偶联基因进行系统进化树分析，鉴定了不同地区的LSDV毒株。

Zheng M等［22］采取了双重PCR方法对山羊痘病毒、绵羊痘病毒与其他痘病毒进行了研究，可不用内切酶进行酶切鉴定其属的特异性，其灵敏度和特异性均较高。Markoulatos P等［23］建立了多重PCR技术检测皮肤组织中的SPPV，采用3对引物，同时扩增，比一对引物的PCR方法具有更高的敏感性和特异性。这提示我们可针对同属的其他几个病毒如LSDV的多个特征性基因设计多条引物，进行扩增，从而建立LSDV的多重PCR技术。

Babiuk S等［24］用实时定量PCR法对人工感染的LSDV牛皮肤等组织中的病毒进行了定量研究，同时与病毒分离法、显微镜观察进行了比较。Lamien C E等［25］根据羊痘G蛋白偶联因子受体特有的分子信号，制备二元杂交探针，成功建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法，通过熔解曲线的不同区分SPV、GPV及LSDV。

目前，我国对牛结节性皮肤病的诊断技术研究较少，仅在1978年采用病毒分离、电镜观察、动物接种等方法对我国首例LSDV进行报道。只是对与LSDV同属的羊痘病毒属的GPV、SPV进行了研究，已经成功构建山羊痘病毒、绵羊痘病毒P32基因的真核和原核表达系统，已建立了检测山羊痘病毒抗体的间接ELISA方法。近年来又开辟了功能性基因的研究。从而我们可以参照山羊痘、绵羊痘病毒的研究方法进行牛结节性皮肤病检测技术的研究。

4 小结

目前，我国境内未发生过牛结节性皮肤病，尚无检测该病的成熟技术。随着我国加入WTO后，与国际间的贸易往来日益频繁，大量的种牛、种羊引进，且该病已有在从非洲大陆传入其他地区的趋势，我国存在大量的易感动物，因此，该病传入我国的可能性较大，应加快对该病诊断技术和疫苗的研究，加强口岸的监管，以有效防止该病的传入。

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