羟基自由基的光度法分析研究进展

于 露 (荆州市环境保护局,湖北荆州434000)

李凡修 (长江大学化学与环境工程学院,湖北荆州434023)

1 分光光度法

2)甲苯胺蓝光度法 何战胜等[5]研究发现羟自由基可与甲苯胺蓝发生氧化反应,且在612nm处羟自由基对甲苯胺蓝溶液具有强烈的褪色作用,能使甲苯胺蓝的吸光发生变化,提出了间接检测Fenton反应中羟自由基浓度的新方法。研究发现,最佳测定条件为pH=4.0。该法稳定性好,操作简便,测定快速,是筛选抗羟自由基的清除剂和有效抗氧化剂药物的简便方法。

4)丁基罗丹明B法 丁基罗丹明B无论在酸性介质中,还是在碱性介质中均显红色,但在稀硫酸介质中,羟自由基与丁基罗丹明B发生反应,使丁基罗丹明B褪色。翟继英[7,8]在722型分光光度计480～620nm范围内测定丁基罗丹明B的吸光度,发现最大吸收波长在554nm处,因此可利用722型光度计上554nm处吸光度的变化,间接测定羟自由基的生成量。

6)萃取-催化氧化光度法 稀土元素的氧化物溶液能催化过氧化氢产生羟基自由基(OH),OH可氧化二苯基碳酰肼生成红色二苯基碳酰腙,经CHCl3萃取后,其萃取液在最大吸收波长563nm处,ΔA563与过氧化氢、稀土的量呈量效关系。刘德启[14]利用上述原理建立萃取-催化氧化光度法测定H2O2的羟基自由基的新方法。在好氧生物体过氧化氢含量的实际水平范围内,该法在离体筛选抗氧剂方面更接近生物体过氧化氢含量的水平,比Fenton试剂要灵敏的多。该法具有仪器简单、体系稳定、操作方便等优点,非常适合于筛选羟基自由基消除剂。

另外利用Fenton反应产生的羟基自由基与染料试剂溴甲酚绿 (Bromocresol green,B G)[15]、溴邻苯三酚红、桑色素等发生氧化反应后使其吸光度值降低,都可建立间接测定羟基自由基的方法[8]。贾之慎等用水扬酸捕获OH后,与Na2WO4和NaNO2显色,510nm比色测定,间接测定羟自由基含量。徐向荣等[9]用DMSO捕获OH形成甲基亚磺酸,在420nm比色测定Fe2+-H2O2体系产生的OH,上述方法均可用于羟自由基清除剂的筛选。

2 荧光光度法

1)苯基荧光酮荧光法 苯基荧光酮 (Phenylfluorone,简称本芴酮)与Fenton试剂作用后,可使其荧光大大降低,其最大激发波长和发射波长分别500nm和420nm,基于苯基荧光酮在反应前后的荧光变化,吴南等建立了一种新的可间接地测定羟自由基方法,并通过顺磁共振法测定苯基荧光酮加入前后的波谱变化来进一步证实该方法的正确性。该方法具有较高的灵敏度,可作为寻找羟自由基清除剂的方法,也可作为医学上部分药品性能检验的有效方法。

在此基础上,任风莲等[16]提出了一种快速、简便地测定Sn(Ⅱ)-H2O2体系产生羟自由基 (OH)的新方法。由于Sn2+可与H2O2作用发生类似Fenton反应,产生大量羟自由基,采用苯基荧光酮phenylfluorone作为Sn(Ⅱ)-H2O2反应体系的荧光试剂,再利用其产生的羟自由基氧化苯基荧光酮,使苯基荧光酮的强度发生变化,可间接地测定羟自由基的产生量。苯基荧光酮荧光法对仪器要求低,方法简便,操作易行,选择性好,准确可靠,是一种值得推广的新型测定羟自由基的有效方法,特别适用于检测离体体系中羟自由基的氧化效应及其清除羟自由基的机理研究。

2)吡啶荧光法 谷学新等[17]利用羟基自由基氧化二甲亚砜 (DMSO)生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Hantzsch反应,其产物3,5-二乙酰-1,4-二氢吡啶可产生特征荧光,其最大激发波长和最大发射波长分别为419.4nm和505.5nm,通过测定荧光强度的变化可间接定量羟基自由基的产生量。该方法简便可靠,不需昂贵仪器,操作简便,易于被一般实验室采用,对于抗氧化剂的筛选以及羟基自由基的机理研究具有一定的应用价值。

3)杨基荧光酮荧光法 水杨基荧光酮 (salicylfluorone,SAF)是一种多羟基芳香酮,由于具有多羟基及较好的刚性平面结构,它本身就能产生荧光,因此任何改变其结构的变化都能改变它的荧光。基于以上原理,Fenton试剂产生的羟自由基与水杨基荧光酮SAF作用后,可生成另外一种荧光物质,从而发生了荧光的变化,可利用荧光强度变化来间接测定所产生的羟自由基[18]。

任凤莲[19]实验中发现Co2+与H2O2反应生成羟自由基的产率比Fenton试剂的高100倍以上,从而建立水杨基荧光酮 (SAF)-CoⅡ-H2O2荧光法测定羟自由基的新体系,其激发波长和发射波长分别为510nm和500nm,利用该测定体系在反应前后的荧光变化,可间接测定羟自由基产生量。该法不需昂贵的仪器设备,方法灵敏,操作简单易行。清除率实验及ESR波谱法检测均证明了该方法的准确可靠,对于医用筛选抗羟自由基药物及抗羟自由基机理研究等方面具有应用价值。

4)Ce3+荧光法 徐向荣等[20,21]利用Ce3+在稀硫酸中能产生特征荧光,其最大激发波长OH和发射波长分别为280nm和360nm。利用Fenton反应或Sn2+与H2O2作用能将Ce3+氧化成无荧光Ce4+,通过测定Ce3+的荧光强度变化可间接测定羟基自由基的产生量。该法仪器简单,操作简便,测定快速,适于羟自由基的在线测定和监控。

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