利用能源牧草柳枝稷生产燃料乙醇的研究进展

肖 晖,王 珣,宋 洋,王秀君,张俐俐,卢泳全,李柱刚

（黑龙江省农业科学院生物技术研究所 黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030）

生物质能源是指来自于生物材料中的可再生能源,可用于加热、发电、燃料以及生产副产物。生物质能源的三大产物为乙醇、生物柴油、生物燃料。乙醇与生物柴油可作为燃料以及重要的化工原材料。因此,乙醇在以石油为基础的经济向以生物质能源为基础的可持续经济和环境友好经济的转变中起着至关重要的作用。目前,全球对于液态燃料的需求日益增加,从植物中分离获得乙醇和生物柴油也随之备受关注。

随着植物细胞壁中纤维素与半纤维素转化为乙醇这项技术的日趋经济化,从生物质能源作物中提取可更新能源作为液态燃料的潜力也逐渐被发掘[1-2]。2002年开始,生物质能源作物的残余物成为研究重点。美国Component of Conservation Reserve Program（CRP）机构研究表明[3-4],在2000-2004年,种植同样面积的柳枝稷（Panicum virgatum）与玉米（Zea mays）,柳枝稷产量要高于玉米秸秆收获量。通过直观比较,多年生牧草能源作物能够在贫瘠边缘土地上产出等同于粮食作物秸秆所产出的相同含量的酒精。本研究从生物学特性、能源开发特性、栽培管理措施以及生物技术方法等方面综述了生物质能源作物柳枝稷的国内外研究进展,为柳枝稷的后续研究提供理论依据。

1 柳枝稷的生物学特征

柳枝稷为直立多年生草本C4植物,其根系发达,株高可达4.0 m,叶片绿色扁平,长约150 cm,宽约1.3 cm[5]。6-8月开花,花序呈圆锥状,15～55 cm长,分枝末端有小穗[6]。种子呈浅褐色,光滑且具有光泽,新收获的种子具有较强的休眠性,品种间千粒重变化较大[5-7]。冬季地上部枯死,地下宿生根系依然存活,次年5月返青。

柳枝稷起源于北美,在对多种能源作物材料的筛选中,柳枝稷因其高产、多年生、具有水土保持能力以及对于贫瘠土地的强适应性等特点而被选为主要的牧草作物。柳枝稷可分为低地型和高地型两种生态型[6],低地型主要分布于美国南部地区,喜潮湿温暖环境,适于种植于低纬度地区,多为四倍体（2n=8×=72）；高地型主要分布于美国中部及北部地区,喜干燥环境,适于种植在中高纬度地区,且大多为八倍体[8]。不同的柳枝稷品种只有种植在与其起源位置相近地区才能表现出较高产量和生态适应性。

2 柳枝稷的能源开发特性

多年生能源牧草因其具有高木质纤维素含量而成为生物能源产品的主要原料。与一年生作物相比,不需每年播种,可生长在贫瘠土地上,具有极强的抗寒能力[9-11]。同时,还可以减少土壤腐化、强化碳元素隔离,给野生生物提供习生地等[10,12-15]。

能源网平衡系统（net energy balance,NEB）在生物能源平台上是一个重要的评价指标,只有具有高效NEB的作物才可以被认为具有生态可持续性和环境可持续性。这对于评价作物以及转化过程是否有实质性的生物技术投资价值是至关重要的。尽管目前在经济学角度上,以玉米淀粉为原料生产出的乙醇以及生物柴油能够替代部分石油,但与以木质纤维素为原料生产的乙醇相比,前两者NEB均低于后者,且具有负面效应（表1）[16-18]。

表1 生物质能源作物在不同平台上的比较

如果具有高效NEB的木质纤维素原料能够被有效地转化为乙醇,那么其产量最高可能达到600 GJ/（hm2·a）,居第二代乙醇燃料首位。因此,目前的首要任务就是构建木质纤维素生物能源的精炼加工。在多种生物能源作物中,柳枝稷已具有潜力成为高NEB作物[17-19]。

3 柳枝稷的栽培与管理

柳枝稷的生物质产量主要受栽培方式、栽培时间以及地理位置的影响,但播种方式与生物技术方法也同样会影响其产量[20]。对于不同生态类型的柳枝稷需选择性种植。Hopkins等[21]指出原始的种植纬度会影响到种植于不同纬度的柳枝稷产量。因此,在改良品种的同时,需考虑到其特异地理位置的种群选择性。肥料管理以及收获时期等因素都影响着生物质能的产量,这些同样直接关系到柳枝稷的成活率、产量、种子品质以及经济回收[22]。而且,这些因素很可能会与土壤和气候相互作用对柳枝稷产量产生短期或长期影响。

基因型与环境的协同作用对于柳枝稷产量有至关重要的影响。Hopkins等[21]曾报道柳枝稷的抽穗期及产量与环境和基因型密切相关,并指出抽穗期过早将会导致产量的降低。另外,雨季的提前也可对品种产生积极的影响,但不显著。基因型成熟化的品种在土壤中扎根较深,故在旱季亦可获得较高产量[19,22]。

土壤类型与氮肥施用量对柳枝稷产量有重要影响,土壤湿度、持水能力作为产量的影响因素,尤其是对那些不耐旱品种的影响显著。研究[22-24]表明,在美国德克萨斯州,严重干旱地带柳枝稷的产量与植株高度极大地受到了影响。土壤湿度通常也会同收获频率或是氮肥施用量等管理因素协同作用来影响产量。Fike等[25]报道,湿润土壤可提高早熟品种产量,但对于刈割一次的栽培系统,湿润土壤对产量变化的影响并不明显。Stout等[26]的研究表明,当降水缺乏的时候,土壤持水能力就会限制产量,此时,氮是影响柳枝稷产量的首要因素。Vogel等[27]和Mulkey等[28]的试验也证明,当氮肥施用量由60 kg/hm2增至 120 kg/hm2时,柳枝稷产量提高28%。CRP项目[26]建议56 kg/hm2为有效施用量,但还需因地域不同、环境不同而进行相应调整。

4 生物技术方法改良柳枝稷

新型可靠的生物技术方法对于降低生物能源成本可起到至关重要的作用,尤其是对于以木质纤维素为原料生产乙醇的作物。核心问题包括引种驯化,克服抗性、纤维素的有效降解,提高生物质含量以及乙醇的产率[29]。

4.1木质素生物合成的修饰 降低木质素的生物合成能够提高糖化作用效率[30-32]。目前研究表明,有2种方法可以对木质素进行修饰。其一,同化木质素结构。木质素的含量与结构同等重要,尽管在木质素分馏过程中,两者相互作用才能够使反应充分,但更为一致的木质素结构会有利于细胞壁的降解,从而高效产出燃料乙醇。其二,如果纤维素含量低于阈值范围,预处理过程就可略去,这样能够加强下游酶的糖化作用以及提高发酵效率[33]。因此,经过木质素修饰的柳枝稷能够提高将生物质转换为发酵糖的效率。

4.2非生物胁迫抗性 水质的优劣以及其他一些非生物胁迫均可限制生物质产量,因此,抗逆性状对于柳枝稷在不能种植作物的边缘土地上生长的适应性就凸显的更为重要。干旱、重金属、盐、冷以及热胁迫都会引发作物相应的反应,而每种胁迫也会引发不同的基因改变[34]。耐盐碱、抗旱的上游通道已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中良好地表达出来[35-37]。但是,到目前为止只有有限的转基因实验使作物成功地表现出非生物胁迫适应性。

对于能源作物的非生物胁迫抗性的研究应从两方面入手。第一,不同作物基因型的不同不应局限在实验室研究中,还应进行大田实验,这些都将为育种与基因工程奠定基础。实际上,柳枝稷在栽培过程中的不同表型已表现出对于水质以及寒冷状况的胁迫适应性。但植物对于水质、冷害以及抗盐性表现出复杂的综合生理反应,同属不同种或同种不同品种间往往表现出很大的差异,即使同一品种对逆境的抗性也会随着生育期的不同而变化。因此对于柳枝稷非生物胁迫抗性的研究应结合不同品种、不同生育时期和不同土壤条件下的多项形态、生理指标及农艺性状进行辨别[34,38-39]。其次,对于模式品种的基础研究应用在大田作物中,模式品种中确认的关键胁迫应答基因应通过基因修饰应用于柳枝稷的能源作物中。

4.3增加产量以及生物质能源生成的方法首先,对于控制作物体系结构的分子机制应有准确的了解。对于目前的田间研究可转换为对生物能源原料体系结构特点改变的研究中。例如,通过分子生物技术手段获得矮秆、直立的作物,从而提高产量。另外,通过对细胞壁生物合成基因的修饰以及酶修饰也可提高生物质能的产量。纤维素合成的过度表达会相应地提高木质纤维素的生物合成[40]。生物质能源的生成也可通过对作物的荷尔蒙应答基因修饰来提高[41-44]。

5 将柳枝稷转换为生物燃料的工艺研究

来源于诸如木材、牧草以及农业或林业废弃物中的木质纤维素原料生产的乙醇燃料作为运输燃料大大地降低了人类对于汽油进口的依赖,同时降低了贸易赤字的不平衡性,改善了城市空气质量,减少了大气中CO2带来的污染,并提供了一个可以促进农业经济的新型市场。同步糖化发酵[45]目前已成为将木质纤维素生物质能转化为乙醇燃料的首选方法,这种方法提高了能量的转化率以及乙醇的产量,与此同时也降低了浓缩乙醇的投入成本。

木质纤维素生物质原料中纤维素的水解可使糖类降解以便进一步将其发酵生成乙醇。在目前的发酵技术中,木质纤维素原料生产乙醇的成本相对较高,产量较低,而且水解过程的耗费也大。目前大量实验都致力于改进木质纤维素原料的水解过程。在预处理过程中,将半纤维素与木质素移除能够明显地促进纤维素的水解。对纤维素酶的优化以及酶负载亦可改善水解过程。同步糖化发酵能够有效地去除葡萄糖带来的对纤维素活性抑制,从而增加乙醇产量并加速纤维素水解效率[46]。

微生物、酵母以及真菌的发酵效率主要表现在其对于木质纤维素水解的抑制过程中。木质纤维素水解类型的不同,抑制剂成分也会发生相应的改变,导致微生物发酵结果各不相同。制约微生物发酵的参数,诸如pH值、温度以及营养素应在发酵过程中予以考虑。在发酵工程中,不仅微生物的特性要作为重要指标考虑,诸如间歇式培养,细胞回收的连续式培养以及原位乙醇的移除等发酵过程选择也尤为重要[47]。

目前用于同步糖化发酵过程中的细菌主要有尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、粗糙脉孢菌（Neu-rospora crassa）,这些都可直接发酵纤维素生成乙醇,但产率不高,还要排除纤维素结晶度带来的影响。其中,尖孢镰刀菌在 34℃厌氧发酵 20和 50 g/L纤维素,可分别获得9.6和14.5 g/L的乙醇,其理论产量分别为89.2%和53.2%。而粗糙脉孢菌发酵1%微晶纤维素和2%碱处理过的纤维素4 d可分别获得5.5和10 g/L的乙醇,其转化率分别为100%和90%[44,48-49]。

6 结论与展望

生物能源的未来期待着更多技术性的突破。诸如细胞壁生物合成,产物代谢等基因研究与通路研究更应作为基础性研究而加以重视。对于生物燃料的应用则需要生物翻译系统的帮助。“组学”技术对于不同发展阶段相对应的细胞壁结构与特点的基因、蛋白质以及代谢的研究具有指导作用,可帮助进一步改进原料种子的适应性。

我国对于能源作物柳枝稷的研究还处于初级阶段,根据对柳枝稷的生长研究,柳枝稷的能源利用应着重发展在诸如沙漠化、盐碱地等边缘土地。力求不占用粮食用地,最大化利用边缘土地。对于柳枝稷的品种适应性改良、栽培以及育种方面的实验研究首当其冲。目前主要任务是增强品种适应性,提高产量与生物质产率,扩大栽培面积,从而进一步研究不同微生物在生物质后期同步糖化发酵过程中的利用情况,逐步使生物能源作物向工业化、商业化发展,而成为新型清洁生物能源。

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