骨形态发生蛋白的信号传导通路及其拮抗因子

梁 源 综述，常 新 审校

(大连医科大学 附属第二医院 口腔科，辽宁 大连 116027)

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)作为转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的一员，可调控细胞的生长和分化，参与神经、骨骼、胃肠等多个组织和器官的形成和发育。在BMPs信号传导过程中，除了通过正调控来放大信号外，还存在一些因子对BMPs的信号传导起负性调节的作用。

1 BMP信号传导通路

1.1 Smad (Mothers against decapentaplegic homolog)通路

在Smad通路中，BMP通过与两种跨膜受体(丝氨酸/苏氨酸激酶受体)相互结合来发挥作用。这两种跨膜受体分别称为Ⅰ型 (BMPR-Ⅰ型)、Ⅱ型(BMPR-Ⅱ型)受体。其中，BMPR-Ⅰ型又可分为BMPR-IA 和BMPR-IB两种[1]。BMP首先与细胞表面的BMPR- I 和BMPR- II复合体结合，BMPR-II 随即被激活，激活后的BMPR-II 使BMPR-I磷酸化，后者随后通过磷酸化细胞内的特定蛋白Smads来活化BMP的下游区信号传导。Smad蛋白根据各自功能不同可分为三类：受体-激活Smads(R-Smads,包括Smad-1,-2,-3,-5,-8):被BMPR- I磷酸化的Smads主要是指此类；共介导Smad(Co-Smads,包括 Smad-4)：它可与激活后的R-Smads形成复合物，随即转位到细胞核内，激活特定的目的基因进行转录；抑制性Smads(I-Smads,包括Smad-6 和-7)：I-Smads对R-Smads 和Co-Smads的活动起拮抗作用[2]。

1.2 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路

MAPK通路是一条独立于Smad的信号通路。MAPK全称为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase,MAPK)它是一类可以把细胞外信号传导到胞内，引起一系列细胞反应的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶。目前，在哺乳动物细胞中发现三种MAPK信号传导通路:①ERKs(细胞外信号调控激酶，Extracellular-signal Regulated Kinases)通路,能够激活膜受体的下游区信号传递、调控细胞的增殖和分化 ②JNKs(Jun氨基末端激酶)通路③P38-MAPK通路，细胞因子或者细胞应激反应都可激活后两种通路[3]。针对BMPs能否激活以上三种MAPK信号传导通路，近年来争议很多。有报道称，BMP-2可激活ERK和P38-MAPK。Guicheux[4]等却认为：BMP-2激活ERKs的作用与表皮生长因子(EGF)相比甚微，然而BMP-2对于P38和JNK却有很强的活化作用。对于BMP-2能激活P38-MAPK通路，人们普遍赞同：BMP-2先与BMPR-I连接成复合体，再通过BMPR-I结合BMPR-Ⅱ共同形成异聚体BISC(BMP-2诱导信号复合体，BMP-2 induced signaling complex)，BMPR-I通过桥蛋白再与TAK1间接连接，TAK1可激活P38MAPK，传导BMP的信号途径。P38-MAPK可通过直接磷酸化某些转录因子使下游目的基因发生转录，表达成骨特异分子，如碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)等[5]。

2 BMPs信号通路的负性调控

BMPs的信号传导受多个水平的负性调控。在细胞外，可通过一些结合蛋白如noggin,chordin与BMP相互作用来阻碍BMP与其自身受体的结合。在细胞内，可通过抑制性Smads(I-Smads，Smad6/ 7) 、Smads遍在蛋白化调控因子(Smurfs)等来调控胞内的信号传导。I-Smads是TGF-β家族信号通路的抑制剂，除了通过与BMPR-I相作用来阻止R-Smads的活化外，还可通过与Co-Smads竞争来防止其形成R-Smad/Co-Smad复合物，以此来阻碍信号的传导；Smurfs可通过特异性的降解BMPR-I和Smad蛋白来抑制信号的转导。在细胞膜水平上，跨膜蛋白BAMBI(BMP 和 Activin 膜结合抑制剂)在减弱BMP信号转导中发挥了重要作用:BAMBI是TGF-β家族信号转导通路的仿真受体,与Ⅰ型受体结构相似,但不具有同样的活性,它可以竞争性地与BMPR-Ⅱ型受体结合,使胞质区的Smad蛋白无法被激活,从而阻断信号转导,影响一系列下游基因的表达[6]。

2.1 BMP信号通路的细胞外拮抗剂

2.1.1 noggin：Noggin 是一种分子量为64 kDa的分泌型糖蛋白，起初是由于将其mRNA注射入爪蟾的胚胎,可使头部明显增大而得名。Noggin在体内对神经系统、骨骼系统等多个系统的发育和/或重塑起调控作用。Noggin能以不同程度的亲和力与BMP-4、5、6、7以及GDF(生长分化因子)-5、6等细胞因子结合(而不与TGF-β家族的其他多肽结合)。其中，noggin与BMP-2,4的亲和力比BMP-7更高。在众多可下调BMP信号的细胞外拮抗剂中，noggin是与BMP最具亲和力的一种蛋白。Noggin通过与细胞表面的BMP受体竞争，特异性的与BMPs结合，阻碍BMP与其自身受体结合及下游区的信号传导从而拮抗BMP的作用[7]。BMPs的表达通常与noggin相伴随，BMPs能够诱导Noggin在成骨细胞中的表达，而Noggin可抑制BMPs的促成骨细胞分化的功能 ，以此来限制BMP的过度表达。Brunet等[8]的实验也提示了这一点。他们发现敲除noggin基因的小鼠，出生后即死亡，这类小鼠都具有粗糙、增厚的长骨，说明noggin对BMP的表达有着重要的调控作用。而Devlin等[9]研究发现，noggin如果过度表达会导致骨小梁数量的减少以及严重的骨量减少。Wan等[10]则发现,在体内用抑制noggin的成骨细胞修复小鼠的缺损颅盖骨，在损伤后的2～4周可见明显的骨再生现象。提示抑制noggin可增强BMP信号转导进而加速成骨作用和骨形成，这具有重要的临床应用价值。

2.1.2 chordin：Chordin与noggin一样，通过与BMPs(BMP-2/4/7)特异性的结合来抑制BMPs的作用。Chordin是一个分子量为120 kDa的蛋白，包含四个富含半胱氨酸(cysteine-rich,CR)区，每个区域各有70个氨基酸，这些区域(尤其是CR1,CR3 )决定着chordin 的功能和结合BMPs的能力。成骨细胞表达的chordin很有限，相反chordin可由软骨细胞表达并可对软骨细胞成熟起调控作用。Zhang等[11]研究发现，chordin有拮抗BMP所诱导的软骨细胞分化的作用。chordin的异位表达会引起小鸡的四肢短小、软骨细胞成熟延迟、矿化区域狭窄,提示chordin在骨骼发育过程中对软骨骨化有负性调控作用。有研究发现BMP-2和chordin在人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的成骨分化过程中都有表达；敲除chordin会导致成骨标志物碱性磷酸酶ALP以及细胞外矿物质的明显增加。这表明在成骨分化过程中，有内源性的chordin产生且对成骨分化起限制作用。

2.1.3 Follistatin 及Follistatin-like：1987年，Robertson等从牛卵泡液中分离出了一种可抑制促卵泡素(FSH)分泌的蛋白：卵泡抑素(follistatin，FS)，起初对follistatin的研究仅限于其在生殖周期中的作用。近年来的研究发现，follistatin不仅存在于许多组织细胞中，还在胚胎及皮肤毛囊的发育过程中发挥着重要的作用[12]。实验发现，虽然follistatin 与activin(ACT，非BMP家族的一类细胞因子)有很强的亲和力，但是follistatin 并不是一种仅仅与ACT 特异性结合的蛋白，它还可以通过与BMP-2，-4,-6,-7结合来抑制它们的作用[13]。但其抑制方式却不同于noggin及chordin。Follistatin是通过BMP来与BMP受体相结合，通过形成一个三聚体结构来发挥作用[6]。研究发现：TGF-β可诱导follistatin表达，而BMPs却起到下调follistatin的作用(不同与 noggin)；follistatin基因缺失的小鼠，出生后不久就会死亡，同时该小鼠会出现包括骨骼在内的多个组织器官的缺陷[14]。对于Follistatin-like的研究相对较少，已知它与Follistatin一样，也可与BMP-2等结合，来抑制由BMP-2介导的转录应答[15]。

2.1.4 Twisted gastrulation(Tsg)：Tsg是一种分子量为23.5kDa的分泌型蛋白，在果蝇中被发现，最初认为其与背腹部轴的形成有关。Tsg的氨基末端有一个高度保守的，富含半胱氨酸的，与chordin蛋白相似的CR区域，该区域可能是BMPs和BMPs拮抗剂的结合位点[16]。Tsg对BMP信号的调控具有正负双重作用。Tsg通过与Chordin及BMPs(BMP-2,BMP-4,BMP-7)形成三元络合物来阻碍BMPs与其自身受体的结合，从而起到拮抗BMP的信号转导的作用；当形成三元络合物后，Chordin会被一种金属蛋白酶Tolloid(Tld)裂解成富含半胱氨酸的片段，该片段可减弱BMP与另外两者的结合能力，使BMP从三元络合物中分离出来，从而促进BMP的信号转导[17]。Gazzerro等[16]实验发现，Tsg过表达会抑制成骨细胞的分化；Nosaka等[18]的研究发现：小鼠Tsg基因发生靶向断裂，会引起颅面部发育缺陷、椎骨畸形及侏儒症,这提示Tsg在作为BMP激动剂时可对软骨内骨化起调控作用。

2.1.5 Dan 家族：Dan 家族是一类能够与BMPs结合的分泌型蛋白。目前发现至少9个成员：Gremlin,Sclerostin,Dan,USAG-1(uterine sensitization associated gene-1),Cerberus,Caronte,Coco,PRDC (Dan 和 Cerberus相关蛋白) 及 Dante[19]。这些蛋白经过序列对比后，人们发现它们C-端共有一段包含九个半胱氨酸的CR区域。尽管Dan家族的大部分成员的主要作用是参与胚胎的发育，在成骨过程中发挥的作用较少，但Gremlin、Sclerostin等却是能够调控BMP成骨活动的重要因子。

Gremlin是一类高度保守的分子量为20.7 kDa的糖蛋白，最初从非洲蟾蜍胚胎中分离出来。Gremlin 除在胚胎发育过程中有表达,也在成年期的动物组织中，如脑、脾、肾、卵巢，及终末分化细胞中有所表达。Gremlin对胚胎的发育、组织器官形态的形成、细胞分化等都有重要的调节作用。它作为BMPs的拮抗剂，能特异性结合并抑制BMP-2,4,7的作用。Gazzerro等[20]研究发现，Gremlin转基因小鼠易出现骨折，Gremlin的过表达会造成股骨骨小梁的骨量下降并有编织骨出现，同时通过偏振光显微镜发现,在骨皮质内膜的表面有杂乱的胶原束形成，表明Gremlin可降低成骨细胞数量及功能，抑制骨形成，引起骨骼结构的改变。

Sclerostin是由SOST基因编码的蛋白。最初的研究发现SOST基因突变会导致Sclerostin表达异常，从而引起严重的的骨代谢性疾病——Sclerosteosis和Van Buchem病(两种先天性发育不良性疾病，以渐进性骨骼增厚和全身性骨样硬化为特点)[19]。通过原位杂交和免疫组织化学技术，人们发现：Sclerostin主要由成骨细胞、骨细胞等特定的细胞分泌。在体外实验发现，Sclerostin抑制成骨细胞的分化和功能，诱导成骨细胞凋亡[19]；在体内实验发现，Sclerostin过表达会导致骨结构紊乱、骨皮质变薄、骨小梁减少、板层骨形成受损、软骨发育不全。Sclerostin作为BMPs的拮抗剂，可与BMP-2,-4,-5,-6,-7结合[21]。但Winkler等[22]对大鼠骨肉瘤细胞系的研究却发现，Sclerostin能与noggin结合形成具有高亲和力的复合物，从而互相抵消两者抑制BMPs活动的作用，这提示在调节BMPs的活性上，BMPs拮抗剂之间也存在着精密的调节机制。除了与BMPs结合以外，Sclerostin还与Wnt的共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP，lowdensity lipoprotein receptor related protein)-5，-6有很高的亲和力，从而来抑制Wnt的信号转导[23]。因此,Sclerostin可通过调控两条独立的信号传导通路来抑制骨沉积。

Dan(Differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma),又称NO3，具有肿瘤抑制基因的活性。由dan 基因编码的19kDa的蛋白可在多个物种的胚胎和成人的组织中表达。已证实Dan可与BMPs结合并抑制它们的信号传导活动[24]。

Cerberus蛋白是一个包括270个氨基酸的，分子量为31 kD的多肽[25]。Cerberus在神经组织的形成过程中可起到非常重要的作用。Cerberus选择性的与BMPs结合，并不与TGF-β家族的其他成员结合。此外，Cerberus可与Wnt8结合并可阻碍其活动。

USAG-1 (uterine sensitivity-associated gene-1)与Sclerostin相似，既是BMP的拮抗剂[26],又可与Wnt的共受体LRP-5 和 -6结合，来作为Wnt信号传导的调节剂[27]。在慢性肾病的实验模型中发现，USAG-1与肾脏纤维化的进展有关[26]。

PRDC (Dan 和Cerberus相关蛋白，protein related to Dan and Cerberus)是通过基因捕获技术从胚胎干细胞中分离出来的，PRDC蛋白与gremlin有一定程度的序列同源性[28]。PRDC可有效的结合并抑制BMP-2,-4，且主要在卵巢、脑、脾等器官中表达。近来，PRDC在体外拮抗BMP-2的活动及参与调控成骨作用的能力已经被证实[29]。

3 结 论

BMPs具有异位成骨能力，能刺激间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞分化。在成骨细胞中，BMPs的激动剂和拮抗剂之间存在着一种精确的平衡，以调控BMP信号传导和骨的形成。认识BMPs的负性调节机制，有利于临床上应用基因治疗等先进技术来抑制拮抗剂的表达，从而促进骨、软骨的形成，以达到治疗目的，有很高的应用前景。

[1] Miyazono K,Maeda S,Imamura T.BMP receptor signaling:transcriptional targets,regulation of signals,and signaling cross-talk[J].Cytokine Growth Factor Rev,2005,16(3):251-263.

[2] Nishimura R,Hata K,Ikeda F,et al.The role of Smads in BMP signaling[J].Front Biosci,2003,8:s275-s284.

[3] Weston CR,Lambright DG,Davis RJ.Signal transduction:MAP kinase signaling specificity[J].Science,2002,296(5577):2345-2347.

[4] Guicheux J,Lemonnier J,Ghayor C,et al.Activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun-NH2-terminal kinase by BMP-2 and their implication in the stimulation of osteoblastic cell differentiation[J].J Bone Miner Res,2003,18(11):2060-2068.

[5] 赵贤,李世昌,李小英.骨形成因子及其信号传导通路述评[J].中国骨质疏松杂志,2008,14(9):680-684.

[6] Balemans W,Van HW.Extracellular regulation of BMP signalingin vertebrates:a cocktail of modulators[J].Dev Biol,2002,250(2):231-250.

[7] Zimmerman LB,De Jesus-Escobar JM,Harland RM .The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4[J].Cell,1996,86(4):599-606.

[8] Brunet LJ,McMahon JA,McMahon AP,et al.Noggin,cartilage morphogenesis,and joint formation in the mammalian skeleton[J].Science,1998,280(5368):1455-1457.

[9] Devlin RD，Du Z，Pereira RC,et al．Skeletal overexpression of noggin results in osteopenia and reduced bone formation[J].Endocrinology,2003,144(5):1972-1978．

[10] Wan DC,Pomerantz JH,Brunet LJ,et al.Noggin suppression enhances in vitro osteogenesis and accelerates in vivo bone formation[J].J Biol Chem,2007,282(36)：26450-26459.

[11] Zhang D,Ferguson CM,O′Keefe RJ,et al.A role for the BMP antagonist chordin in endochondral ossification[J].J Bone Miner Res,2002,17(2):293-300.

[12] McDowall M,Edwards NM,Jahoda CA,et al.The role of activins and follistatins in skin and hair follicle development and function[J].Cytokine Growth Factor Rev,2008,19(5-6):415-426.

[13] Glister C,Kemp CF,Knight PG.Bone morphogenetic protein(BMP)ligands and receptors in bovine ovarian follicle cells:actions of BMP-4,-6 and -7 on granulosa cells and differential modulation of Smad-1 phosphorylation by follistatin[J].Reproduction,2004,127(2):239-254.

[14] Canalis E,Economides AN,Gazzerro E.Bone morphogenetic proteins,their antagonists,and the skeleton[J].Endocr Rev,2003,24(2):218-235.

[15] Tsuchida K,Arai KY,Kuramoto Y,et al.Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-βfamily[J].J Biol Chem,2000,275(52):40788-40796.

[16] Gazzerro E,Deregowski V,Vaira S,et al.Overexpression of twisted gastrulation inhibits bone morphogenetic protein action and prevents osteoblast cell differentiation in vitro[J].Endocrinology,2005,146(9):3875-3882.

[17] Petryk A,Shimmi O,Jia X,et al.Twisted gastrulation and chordin inhibit differentiation and mineralization in MC3T3-E1 osteoblast-like cells[J].Bone，2005,36(4):617-626．

[18] Nosaka T,Morita S,Kitamura H,et al.Mammalian twisted gastrulation is essential for skeleto-lymphogenesis[J].Mol Cell Biol,2003,23(8):2969-2980.

[19] Gazzerro E,Canalis E.Bone morphogenetic proteins and their antagonists[J].Rev Endocr Metab Disord,2006,7(1-2):51-65.

[20] Gazzerro E,Pereira RC,Jorgetti V,et al.Skeletal overexpression of gremlin impairs bone formation and causes osteopenia[J].Endocrinology,2005,146(2)：655-665.

[21] Winkler DG,Sutherland MK,Geoghegan JC,et al.Osteocyte control of bone formation via sclerostin,a novel BMP antagonist[J].EMBO J,2003,22(23):6267-6276.

[22] Winkler DG,Yu C,Geoghegan JC,et al.Noggin and sclerostin bone morphogenetic protein antagonists form a mutually inhibitory complex[J].J Biol Chem,2004,279(35):36293-36298.

[23] Li X,Zhang Y,Kang H,et al.Sclerostin binds to LRP5/6 and antagonizes canonical Wnt signaling[J].J Biol Chem,2005,280(20):19883-19887.

[24] Dionne MS,Skarnes WC,Harland RM.Mutation and analysis of Dan,the founding member of the Dan family of transforming growth factor-βantagonists[J].Mol Cell Biol,2001,21(2):636-643.

[25] Conaway RC,Brower CS,Conaway JW.Emerging roles of ubiquitin in transcription regulation[J].Science,2002,296(5571):1254-1258.

[26] Yanagita M,Oka M,Watabe T,et al.USAG-1:a bone morphogenetic protein antagonist abundantly expressed in the kidney[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,316(2):490-500.

[27] Ellies DL,Viviano B,McCarthy J,et al.Bone density ligand,Sclerostin,directly interacts with LRP5 but not LRP5G171V to modulate Wnt activity[J].J Bone Miner Res,2006,21(11):1738-1749.

[28] Minabe-Saegusa C,Saegusa H,Tsukahara M,et al.Sequence and expression of a novel mouse gene PRDC (protein related to DAN and cerberus) identified by a gene trap approach[J].Dev Growth Differ,1998,40(3):343-353.

[29] Ideno H,Takanabe R,Shimada A,et al.Protein related to DAN and cerberus (PRDC) inhibits osteoblastic differentiation and its suppression promotes osteogenesis in vitro[J].Exp Cell Res,2009,315(3):474-484.