头颈部癌肿瘤干细胞候选标志物的研究进展

刘 涵，肖 晶

(大连医科大学 口腔医学院 口腔基础教研室，辽宁 大连 116044)

近年来，许多学者提出了肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)假说，即肿瘤组织中存在极少量的肿瘤细胞，此类细胞具有无限自我更新的潜能，在启动肿瘤形成和生长过程中起着决定性的作用。

1994年，Lapidot等[1]首次通过特异细胞表面标志分离出了人急性粒细胞性白血病干细胞(leukemic stem cell，LSC)，发现只有LSC才具有不断自我更新维持其恶性显型的能力，从而证明了肿瘤干细胞的客观存在。2003年，Al-Hajj等[2]率先在人乳腺癌中分离纯化出了乳腺肿瘤干细胞(breast cancer initiating，BRCa-IC)。这类细胞仅占肿瘤细胞的2%，并且具有极强的自我复制更新能力与不断分化能力。BRCa-IC的发现证实了实体肿瘤干细胞的存在。

研究肿瘤干细胞的首要工作就是其表面标志物的筛选与鉴定。国内外利用肿瘤干细胞标志物已从多种上皮性来源的实体瘤中筛选出了肿瘤干细胞，但对头颈部癌干细胞表面特异性标志物尚无统一的结论。本文就近年来肿瘤干细胞候选标志物在头颈部癌和其他上皮性实体瘤中的研究进展综述如下。

1 肿瘤干细胞标志物在上皮性实体瘤中的研究

1.1 CD44

CD44是细胞粘附分子(CAM)家族中的一种糖蛋白，是透明质酸类的主要受体。人类CD44基因位于11q13，全长约50 kb，共由20个高度保守的外显子组成。正常情况下，CD44主要参与淋巴细胞的激活以及细胞与细胞间、细胞与间质间的特异性粘附过程。

2003年，Al-Hajj等[2]通过特异性的细胞表面标志率先在人的乳腺癌中分离纯化出了以Lin-ESA+CD44+CD24-/LOW为特异细胞表面标志的BRCa-IC。这类细胞仅占肿瘤细胞的2%，并且在NOD/SCID小鼠的成瘤能力至少是其他肿瘤细胞的50倍，即使少于100个细胞也能够在体内成瘤，同时也可在小鼠体内连续传代。这种转移瘤既有BRCa-IC，又含有其他肿瘤细胞。这提示，极强的自我复制更新能力与不断分化能力是BRCa-IC的两个主要特性。Ponti等[3]对从患者乳腺癌组织来源的癌细胞和乳腺癌细胞系进行体外培养时，发现培养液中均含具有自我更新能力的未分化细胞，其表面标志为CD44+/CD24-/Cx43-。CD44+细胞过表达于新生血管因子和细胞保护因子，将103个CD44+细胞注射到NOD/SCID 小鼠乳腺脂肪垫时可形成新的肿瘤。

1.2 CD133

CD133是一种人造血干细胞的跨膜糖蛋白，分子量为120 kDa，为单拷贝的基因产物。该基因位于4p15，包含37个外显子，由865个氨基酸组成。

当用可引起细胞分化的丁酸钠处理结肠癌HT29 和Caco2细胞系后，其CD44和CD133阳性表达均下降，且CD44下降率高于CD133。因此，CD44被认为更适合作为未成熟癌细胞的表面标志物[4]。为了进一步证明CD44+/CD133+的致瘤性，将CD44+/CD133+、CD44+/CD133-、CD44-/CD133+及CD44-/CD133-细胞分别注入同一只小鼠的不同部位，发现仅有CD44+/CD133+组具有致瘤性。O’Brien 等[5]将CD133抗体注入来源于患者结肠癌的肿瘤细胞并植入NOD/SCID小鼠体内，发现仅需 100 个具有 CD133+表型的结肠癌细胞就能形成肿瘤，而 CD133-表型则至少需 2.5×105才能形成肿瘤。因此，CD44+/CD133+被认定为人结肠癌干细胞标志物。

Collins等[6]用免疫磁珠和胶原粘附法从前列腺癌中筛选纯化出了分子标记为 CD44+/α2β1hi/CD133+的肿瘤细胞。此类细胞只占细胞总量的0.1%，可分化成多种细胞类型，有高度的增殖潜能，同时在体外培养的细胞克隆形成率和增殖潜能明显大于同一组织来源的表型为CD44+/α2β1hi/ CD133-或 CD44+/α2β1low的细胞群。

Milsom等[7]发现在高致瘤性的人皮肤基底细胞癌细胞系A431中有小群细胞亚型(占肿瘤细胞的0.5%)具有异质性，均呈CD133强表达。利用免疫磁珠分选法发现CD133阳性细胞表面高表达凝血激酶抗原，提示了此群肿瘤细胞具有较强侵袭性和促凝血作用。

1.3 ABCG2

ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G2)是ABC转运蛋白超家族的成员之一，是一种P-糖蛋白。其基因定位在4q22，由16个外显子和15个内含子组成。

1996年，Goodell等[8]首次利用流式细胞仪在小鼠骨髓中分离出一小群SP(side population)细胞，因其有极强的外排染料功能而呈现Hoechst33342(核酸结合染料)低染。这群细胞不仅表达造血干细胞的表面标志，而且仅正常量的千分之一即可重建骨髓造血系统，因此此法常被用于未知表面标志的干细胞分选。近几年研究显示SP表型与ABCG2表达呈强相关[9]，即在不同来源的SP细胞均呈高表达，提示ABCG2可作为SP细胞的表型标记物。

张弦等[10]利用免疫磁珠分离技术获取了人卵巢癌A2780细胞系中ABCG2+表型细胞，占总细胞数2%左右，与流式细胞法分选出SP细胞数量相近。在细胞体外克隆形成实验中，ABCG2+细胞克隆率略高于ABCG2-细胞，差异无显著性意义，但ABCG2+细胞对化疗药物耐受能力则明显高于ABCG2-细胞。

1.4 Oct-4

Oct-4属于POU转录因子家族中的一员，是由POU5F1基因编码产生的，定位于6p21.3，是胚胎早期发育中起重要作用的干细胞转录因子。它不仅是细胞全能性的重要标志，也是维持细胞多能性的重要转录因子。在低密度细胞培养的卵巢癌细胞系中，可分选出的具有卵巢癌干细胞特性的两种细胞系A2和A4-T，均表达干细胞标记分子Oct-4、Nestin及Nanog，将该细胞注入小鼠体内可形成肿瘤[11]。

2 肿瘤干细胞标志物在头颈部癌中的研究进展

2007年，Prince等[12]首次利用免疫缺陷小鼠模型，测试原发性未经治疗的人头颈部鳞癌病例里不同类型肿瘤细胞的成瘤能力。发现有一小群CD44+肿瘤细胞(占肿瘤细胞比例<10%)，具有自我更新、增殖分化和体内成瘤能力，在RNA和蛋白水平都高表达于干细胞相关基因Bmi-1。同年，在头颈部鳞癌CaLH2和CaLH3细胞系的克隆集落中，发现增殖活性强的全克隆细胞表面高表达β-catenin和CD44，高表达β-catenin和CD44的克隆集落被认为存在不断自我更新增殖的肿瘤干细胞[13]。

Atsumi等[14]从头颈部咽癌Gun-1细胞系中分离出CD44+细胞。同时，高表达CD133和ABCG2，并具有体外肿瘤形成、增殖、转移、侵袭以及一定的抗化疗能力，在CD44+细胞群中与抗化疗相关的基因ABCB1，ABCG2，CYP2C8和TERT等也呈正调节。在对人喉癌细胞系Hep-2的研究中，发现有3.22%的微量细胞CD133呈阳性表达，CD133+癌细胞有比其他细胞亚群强的体外分化和增殖能力[15]。

Zhang等[16]利用流式细胞术在口腔鳞癌细胞中分离筛选出的SP细胞，在裸鼠体内具有成瘤能力，可高表达ABCG2、ABCB1、CD44、Oct-4、Bmi-1、NSPc1和CK19基因。在其他的研究中，体外培养口腔鳞癌细胞可形成肿瘤球，此细胞球富含肿瘤干细胞并可高表达干细胞标志物和ABC运载体基因(Oct-4， Nanog， CD117， Nestin， CD133和ABCG2)[17]。而Nanog/ Oct-4/ CD133三者的阳性表达与口腔癌患者较差的预后具有相关性。

宋娟等[19]研究发现干细胞转录因子Oct-4在口腔鳞癌的小部分癌细胞中呈高表达。这些少量的具有多潜能分化的肿瘤干细胞具有诱发并维持口腔鳞癌恶性表达的能力。同时认为恶性程度越高，肿瘤干细胞所占的比例越大。王开等[20]在对舌鳞癌细胞系Tca-8113研究时发现其具有异质性，仅有约5.09%的肿瘤细胞具有持续增殖并形成细胞克隆的能力。

目前认为，肿瘤治疗后的复发可能与肿瘤干细胞的存在有关，消除肿瘤干细胞是肿瘤治疗成功、防止复发的关键。然而迄今为止，虽然通过特定表面标记物，已从多种上皮性来源的实体瘤中筛选出了肿瘤干细胞，如乳腺癌[2]、前列腺癌[6]、卵巢癌[11]、结肠癌[4]以及头颈部鳞癌[14]等。但由于实体性肿瘤本身干细胞数量少，肿瘤干细胞标记物的特异性较低，仍给分离及鉴定肿瘤干细胞带来很大的困难。大多数研究者都是通过体外细胞系培养和动物体内成瘤模型方式来研究肿瘤干细胞的自我更新及增殖能力的。但此结果是否能真实反映肿瘤干细胞在体内及肿瘤组织内的存在、作用及机制，仍有待研究。

参考文献:

[1]Lapidot T， Sirard C， Vormoor J， et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[2]Al-Hajj M， Wicha MS， Benito-Hernandez A， et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci,2003,100:3983-3988.

[3]Ponti D， Costa A， Zaffaroni N，et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties[J].Cancer Res,2005,65(13):5506-5511.

[4]Haraguchi N， Ohkuma M， Sakashita H，et al.CD133+CD44+population efficiently enriches colon cancer initiating cells[J].Ann Surg Oncol,2008,15(10):2927-2933.

[5]O′Brien CA， Pollett A， Gallinger S，et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumor growth in immunodeficient mice[J].Nature,2007,445(7123): 106-110.

[6]Collins AT,Berry PA，Hyde C，et al.Prospective identifi- cation of tumorigenic prostate cancer stem cells[J].Cancer Res,2005,65(23): 10946-10951.

[7]Milsom C， Anderson GM， Weitz JI，et al.Elevated tissue factor procoagulant activity in CD133-posotive cancer cells[J].J Thromb Haemost,2007,5(12):2550-2552.

[8]Goodell MA， Brose K， Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo[J].J Exp Med,1996,183(4):1797-1806.

[9]Kim M， Turnquist H， Jackson J，et al.The multidrug resistance transporter ABCG2 (breast cancer resistance protein 1) effluxes Hoechst 33342 and is overexpressed in hematopoietic stem cells[J].Clin Cancer Res,2002,8(1):22-28.

[10]张弦,蒋翠莲,王宝偲,等.基于SP细胞分选法初步鉴定卵巢癌干细胞表面标志[J].东南大学学报(医学版),2009,28(6)：491-496.

[11]Bapat SA， Mali AM， Koppikar CB，et al.Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer[J].Cancer Res,2005,65(8):3025-3029.

[12]Prince ME， Sivanandan R， Kaczorowski A，et al.Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci,2007,16,104(3):973-978.

[13]Harper LJ， Piper K， Common J，et al.Stem cell patterns in cell lines derived from head and neck squamous cell carcinoma[J].J Oral Pathol Med,2007,36(10):594-603.

[14]Atsumi N,Ishii G,Kojima M，et al.Podoplanin,a novel marker of tumor-initiating cells in human squamous cell carcinoma A431[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,373(1):36-41.

[15]卫旭东,周梁,程磊,等.CD133作为喉癌肿瘤起始细胞标志的实验研究[J].中华耳鼻喉头颈外科杂志,2006,41(12)：940-944.

[16]Zhang P， Zhang Y， Mao L，et al.Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes[J].Cancer Lett,2009,277(2):227-234.

[17]Chiou SH， Yu CC， Huang CY，et al.Positive correlations of Oct-4 and Nanog in oral cancer stem-like cells and high-grade oral squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(13):4085-4095.

[18]Wei XD， Zhou L， Cheng L，et al.In vivo investigation of CD133 as a putative marker of cancer stem cells in Hep-2 cell line[J].Head Neck,2009,31(1):94-101.

[19]宋娟,严宁,张汉东,等.口腔鳞癌组织中干细胞转录因子Oct-4的表达及意义[J].临床口腔医学杂志,2010,26(7)：390-393.

[20]王开,康非吾,闵睿,等.Tca-8113细胞系单细胞体外增殖的实验观察[J].口腔颌面外科杂志,2008,18(6)：398-401.