自体骨髓干细胞动员治疗脑梗死的研究进展*

肖广正，孔祥玉，赵淑敏

（承德医学院，河北承德 067000）

综述讲座

自体骨髓干细胞动员治疗脑梗死的研究进展*

肖广正，孔祥玉，赵淑敏△

（承德医学院，河北承德 067000）

骨髓干细胞；动员；粒细胞集落刺激因子；脑梗死

成体干细胞的转分化现象近年来不断引起众多学者的注意，许多实验证实了成体干细胞在体内可以改变其已经设定的方向而向另一方向转化。越来越多的证据表明，胚胎脑和成年脑内均存在具有自我更新和多种分化潜能的神经干细胞[1]。脑梗死虽然可诱导内源性干细胞增殖[2]，但由此而诱导的自身修复能力非常有限。另外，神经干细胞移植虽然为缺血性脑损伤的治疗带来了生机，但伦理、来源、移植损伤和排斥反应等因素也限制了其临床应用。

骨髓干细胞动员是新兴的细胞移植方法，利用细胞因子使主要位于骨髓中的干细胞进入外周血，通过血液循环到达损伤组织，以达到细胞移植的目的，具有操作简便、无创伤等优点。近年来，该方法己被推广至急性心肌梗死[3]和脑梗死[4]的治疗，以促进心肌细胞或神经细胞的再生。

1 骨髓干细胞

骨髓干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始骨髓细胞，至少含有三种干细胞，即造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞等。

1.1 造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC) 最早应用于临床，通常用于治疗造血系统疾病。CD34为其公认的细胞表面标记，可以以此对其进行检测和定位。最近的研究表明，HSC除向红系、粒系(分中性、嗜酸性和嗜碱性三类)、巨核细胞系、淋巴细胞系等多种血细胞方向分化外，还可向肌肉细胞、肝细胞、神经细胞等方向分化。

1.2 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有细胞分化能力，来源于骨髓，主要起支持作用，因而又被命名为骨髓基质细胞，但目前并没有找到MSC的特异性标志分子。新近的研究发现，MSC除作为细胞外基质起支持和调节HSC自我更新和分化的作用外，本身也具有多向分化潜能，如在一定诱导条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等。

1.3 内皮祖细胞(endothelial p recursor cell，EPC) 是血管内皮细胞的前体细胞，能够特异性地归巢于血管新生组织，并分化为血管内皮细胞，EPC也具有横向分化为其它细胞的能力。实验证实 ，EPC在特定条件下可分化为血管平滑肌细胞，可替代凋亡或坏死的内皮细胞，从而保留内皮功能，修复受损内皮层，参与重症缺血区血管的形成。EPC和HSC来源于共同的成血管细胞，表达共同的细胞表面抗原，如Flk21/KDR、Tie22和CD34等。

2 BMSC动员

2.1 动员 骨髓干细胞在机体内的定向迁移分为两种，我们把BMSC向机体的炎症区、缺血区等损伤组织定向迁移的过程称为“归巢”，“动员”则是将BMSC从骨髓腔中释放到外周循环中。

2.2 主要动员剂 目前所使用的动员剂主要有粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulo-cyte-macrophage-colonystimulating factor,GM-CSF)、白 细 胞 介 素(interleukin,IL) -27、IL-3、IL-12、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)、基质细胞衍生因子(stromalcell-derived factor-1,SDF-1)和化疗药物，如环磷酰胺(cyclphosphamide,Cy)等，以G-CSF、GM-CSF应用最为广泛。G-CSF、GM-CSF在动员造血干细胞的同时，对EPC和骨髓间充质细胞也有动员作用[5]。

3 G-CSF及其受体

3.1 G-CSF及其受体结构与分布 G-CSF是一种由多肽链组成的细胞生长因子，由174个氨基酸残基组成，分子量为19.6×103，其基因定位于17号染色体q21-22，天然存在的G-CSF由四个单环通过氨基酸环相连。正常情况下，人类血浆中G-CSF的浓度很低。G-CSF受体是由813个氨基酸残基组成的具有典型Ⅰ型细胞因子受体家族结构的糖蛋白。G-CSF受体由位于1号染色体p35-p34.1的单个基因编码，其结构由胞外区、跨膜区和胞质区组成，胞外区包括端免疫球蛋白区和3个纤维连接蛋白Ⅲ重复区。G-CSF受体分布于HSC和中性粒细胞及其前体细胞。研究证实，G-CSF具有较强的动员BMSC的作用。

3.2 G-CSF动员骨髓干细胞的机制

3.2.1 基 质 细 胞 衍 生 因 子(SDF-1）及 其 受 体CXCR4：SDF-1属于趋化因子CXC亚家族，名称为CXCL12，不同种群间保守性极强，人源 SDF-1基因定位在10号染色体长臂，主要在骨髓基质细胞表达，也在骨髓内皮细胞及CD34+、CD38+造血祖细胞中连续表达。SDF-1受体CXCR4是7次跨膜的G蛋白耦联受体，在白细胞、CD34+造血干细胞及CD34+造血祖细胞表面都有广泛表达[6]。研究发现，SDF-1缺陷的小鼠和CXCR4缺陷的小鼠出现相同的造血功能障碍、心脏和小脑发育异常，因此认为CXCR4是SDF-1的唯一受体，SDF-1是CXCR4的唯一配体。SDF-1通过一组碱性氨基酸结合到骨髓基质细胞膜上的硫酸乙酰肝素上，暴露其氨基末端信号区，以便与其受体CXCR4相互作用，从而固定在细胞表面，发挥其生物学活性。

3.2.2 SDF-1/CXCR4相互作用对HSC定植的影响：在定植过程中，HSC沿骨髓血管壁滚动并锚定，存在于内皮细胞表面的趋化因子激活HS表面的整合素，促使其与内皮细胞表面的免疫球蛋白样受体结合，发生跨内皮细胞的移行，最后定居在骨髓腔微环境中。SDF-1/CXCR4之间的相互作用和信号传递，是调节体内稳态和损伤时HSC的动员、归巢和定植的主轴。

动员的CD34+BMSC表面表达受体CXCR4，骨髓基质细胞表面表达的SDF-1能特异性地对CXCR4产生趋化作用。表面表达CXCR4的HSC沿着SDF-1的浓度梯度迁移，实现定植过程。细胞因子如G-CSF、SCF和IL-6则能在24-48h内上调CXCR4在CD34+细胞上的表达，增加SDF-1介导的迁移、归巢和增殖的效率。

G-CSF主要动员HSC入血，但由于HSC没有G-CSF受体，因此，G-CSF动员BMSC的具体机制目前尚不清楚[7]。这提示其对骨髓的动员作用可能存在其它的机制，如G-CSF能促进SDF-1下调及其受体CXCR4的表达上调；G-CSF能促进HSC的动员迁移，这一作用可通过抗CXCR4的抗体所阻断。说明G-CSF动员BMSC可能是通过SDF-l/CXCR4来实现[8]。

4 BMSC动员治疗脑梗死的机制

4.1 动员的BMSC穿过血脑屏障 当脑组织缺血梗死时，血脑屏障已被破坏，G-CSF可动员骨髓干细胞到外周血。循环中的干细胞可以透过血脑屏障，进入脑实质，并迁移至受损脑组织，释放某种营养因子，甚至分化为神经元和神经胶质细胞，从而增加神经细胞数量，增强其代偿修复的能力[9]。

4.2 归巢的BMSC治疗脑梗死的具体机制 骨髓干细胞动员治疗缺血损伤的构想，是基于人们对 BMSC可塑性的认识：在生理或病理情况下，BMSC可被征募到外周循环中，参与远处多种组织的修复和再生，其可塑性主要依赖于所处的微环境。这种内源性动员作用较弱，因此，可以应用动员剂将BMSC驱赶至外周血，使外周血干细胞达到治疗数量，并归巢于损伤组织，在特定的微环境作用下分化为受损组织细胞，以达到修复缺血损伤的目的。目前，骨髓干细胞动员治疗脑梗死作用的具体机制存在较多争议，其可能机制是： ①分化为神经细胞：BMSC分化为神经细胞，替代/修复损伤的细胞，重建神经环路。研究表明，动员大鼠自体HSC，促进其向脑梗死区迁移，可以分化为神经元前体细胞[10]。②重建血循环： BMSC中含有EPC，缺血性损伤及干细胞动员剂能动员EPC到外周血液中，并归巢到缺血组织，分化成内皮细胞，形成新血管。实验证实，BMSC参与了缺血性脑损伤区的新血管形成[11]。③分泌细胞活性因子：动员出来的BMSC与机体相互作用而分泌一些细胞因子，来促进神经功能的恢复。BMSC能够不断分泌脑衍化神经营养因子、神经生长因子及转化生长因子β等神经营养因子[12]，对缺血后的脑组织起到神经保护及修复作用。④抑制神经细胞凋亡：动员的HSC对脑缺血-再灌注损伤的保护作用，其机制可能是通过下调C-FOSmRNA的表达而降低神经细胞凋亡[13]。BMSC通过激发受损神经元内源性存活信号途径，抑制神经细胞的凋亡，而且这些受到刺激的神经细胞与BMSC的相互作用，进一步增强了其神经保护作用[14]。

5 前景及展望

利用G-CSF在早期即可将BMSC征募到外周血循环中，并在缺血梗死区所释放的趋化因子的作用下，迁移到受损脑组织，在特定微环境的诱导作用下分化为神经细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，从而参与脑组织的再生，改善受损脑组织的功能[15，16]。采用G-CSF动员BMSC与骨髓穿刺获得干细胞相比，不存在无菌条件要求高、干细胞获取量有限、易混入外周血等缺点，因此，其临床应用不受限制[17]。但是采用G-CSF动员BMSC仍然存在一些问题，如尚未明确诱导剂的最小有效剂量、最大安全有效剂量及动员的最佳时机；远期疗效值得关注，现在还没有动物实验证实其长期应用安全性的观察报告；脑功能改善程度有待进一步研究；是否会导致其它部位组织内血管增生，是否会促进潜在肿瘤的生长和转移等。尽管如此，我们已经从大量的动物实验及少数临床研究中看到了以G-CSF为代表的动员剂在脑血管疾病中的广阔应用前景[18-20]。

[1]Gould E, Reeves AT,Graziano MS,et al.Neurogenesis in the neocortex of adult primates[J].Science,1999,286:548-552.

[2]Zhang RL,Zhang ZG,Zhang L,et al.Proliferation and diferention of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia[J]. Neuroscience,2001,105:33-41.

[3]Orlic D,Kajstura J,Chimenti S, et al.Mobilized bone marrow stem cells repair the infarcted heart,improving function and survival[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001, 98:10344-10349.

[4]Nikola S, Philip M, Mark R, et al. Granulocyte-colony stimulating factor mobilizes bone marrow stem cells in patients with subacute ischemic[J].Stroke,2006,37: 2979- 2983.

[5]Shargorodsky M, Leibovitz E, Lubimov L, et al.Prolonged treatment with the AT1 receptor blocker,valsartan, increases small and large artery compliance in uncomplicated essential hypertension[J].Am Hypertens,2002,15:087-1091.

[6]Nshio N, Hisha H, Ogata H, et al. Chengs in markers,receptor sandad hensionmolecules expressed on marine hemopoietic stem cells after a single injection of 5-fluoror acil[J].StemCell,1996,14:584-591.

[7]Heissig B,Hatteri K,Dias S,et al.Recruiment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP-9 mediated release of kit-ligand[J].Cell, 2002, 109(5):625-627.

[8]杨敏，闫纯英，吴贤仁，等.骨髓干细胞动员后归巢梗死心肌机制研究[J].中国急救医学，2005，25(3)：190-191.

[9]袁霞，董万利，方琪，等.基因重组人粒细胞集落刺激因子在大鼠局灶性脑缺血中促进神经细胞分化作用的实验研究[J].中国急救医学，2009，26(4)：139-141.

[10]张子强，高顺宗，刘雪平，等.G-CSF动员自体造血干细胞在大鼠MCAO /R模分化为神经元样细胞[J].基础医学与临床，2004，24(3)：310-313.

[11]Hess DC,Hill WD,Martin-Studdard A,et al.Bone marrow as a source of the lial cells and NeuN2exp ressing cells after stroke[J].Stroke,2002,33(5):1362-1368.

[12]Dormady SP, Bashayan O, Dougherty R, et al.Immortalized multipotential mese- nchymal cells and the hematopoietic microenviroment[J].Hematother Stem Cell Res, 2001,10(1):125-140.

[13]张子强，朱竹先，刘雪平，等.动员造血干细胞对局灶性缺血再灌注大鼠脑组织C-FOSmRNA表达的影响[J].基础医学与临床，2006，26(4)：420-424.

[14]Isele NB,Lee HS,Landshamer K,et al. Bone marrow stromal cells mediate protec-tion through stimulation of P I32K/ Akt and MAPK signaling in neurons[J].Neurochem Int, 2007,50(1):243-250.

[15]José Suárez de Lezo,Torres A,Herreral,et al.Effects of stemcell mobilization with recombinant human granulocyte colony stimulating factor in patients with percutaneously revascularized acute anterior myocardial infraction[J].Rev Esp Cardial,2005,58(3):253-261.

[16]Wang Y, Tagil K, RipaRs, et al.Effect of stem-cell mobilization with recombinant human granulocyte colony stimulating factor on clinical symptoms,Left ventricutar perfusion and function in patients with severe chronic ischemic heart diease [J]. Cardiol,2005,100(3):477-483.

[17]Kang S,Yang Y, Li CJ, et al.Effectiveness and tolerability of administration of granulocyte colony stimulating factor on left ventricular function in patients with myocardial infraction:a meta-anlysis of randomized controlled trials[J]. Chin Ther,2007,29(11):6-18.

[18]Xifa L,Hua Q,Wenxia Y,et al.Granulocyte-colony stimulating factor inhibits neuronal apoplosis in a rat model of diabetic cerebral ischemia[J].Tohoku Exp Med, 2008,216:117-126.

[19]Sprigg N,Bath P, Zhao L, et al. Granulocyte-colony stimulating factor mobilizes bone marrow stem cells in patients with subacute ischemic stroke[J]. Stroke,2006, 37:2979-2983.

[20]Jens M, Jan H, Jurgen W, et al. Meta-analysis of the efficacy of Granulocyte-colony stimulating factor in animal models of focal cerebral ischemia[J].Stroke,2008,39: 1855-1861.

R743

A

1004-6879(2011）02-0179-03

2010-11-24）

* 河北省教育厅资助项目(2006303）△ 通讯作者